黃花蒿抗瘧相關成分及抗氧化活性對施肥方式的響應

羅世瓊，石安東，袁玲，黃建國*

(1．西南大學資源環境學院，重慶400716;2．貴州師范大學生命科學學院，貴州貴陽550001)

黃花蒿(Artemisia annua)為菊科一年生草本植物，具有清熱、解暑、退黃、截虐等功效，用于陰虛發熱，署邪發熱，瘧疾寒熱，骨蒸勞熱，溫邪傷陰，夜熱早涼，濕熱黃疸等［1］，已臨床應用2000多年。黃花蒿的主要化學成分包括萜烯類、黃酮類、香豆素、苯丙酸類和揮發油等［2］。其中，屬萜烯類的青蒿素是目前世界上治療瘧疾的首選藥物 (世界衛生組織推薦)［3］。青蒿酸是合成青蒿素的前體［4］，具有抗細菌和真菌等活性［5］;青蒿素脫掉1個氧原子形成去氧青蒿素，也具有抗瘧活性，但總體降低青蒿素的抗瘧藥效［6］。黃酮類不僅具有擴張冠狀動脈、降血壓、防止冠脈粥樣硬化、抗癌等作用，臨床上用于治療冠心病和高血壓［7］;而且還具有清除自由基，保護細胞，延緩衰老的功效，并與青蒿素起協同抗瘧和抗癌的作用［8-9］。因此，黃花蒿可用于人和動物的疾病治療和保健［2，8］。有研究表明，以黃花蒿作為反芻動物的飼料添加劑，不僅向動物提供所需的纖維素、大量元素、微量元素、氨基酸及維生素等，而且還含有黃酮和抗氧化活性成分［8］，可預防和治療動物的某些疾病，如肉雞柔嫩艾美耳球蟲病等［10］。

目前，有關施肥對黃花蒿生長和青蒿素含量的影響研究較多。適量施用氮肥促進黃花蒿生長，提高生物產量［11］，增加肥料中的磷鉀比例提高青蒿素含量［12］。但是，在黃花蒿栽培過程中，施肥方式對抗瘧相關成分的影響及其與抗氧化活性的關系研究甚少，而黃花蒿體內的抗瘧相關成分和抗氧化活性與其作用和藥效密切相關。為此，論文研究了在不同施肥條件下，黃花蒿的生長、青蒿酸、去氧青蒿素、青蒿素、總黃酮的含量分布和抗氧化活性等，旨在為提高黃花蒿的品質和科學施肥提供理論依據。

1 材料與方法

1．1 試驗材料

供試黃花蒿品種為渝青1號(渝品審鑒2009008)，青蒿素含量高達2%，大面積種植于重慶市武陵山區和三峽庫區，由重慶市中藥研究院李隆云研究員鑒定并提供種子。

供試土壤采自重慶北碚典型、具有代表性黃砂壤，pH 6．5，有機質 18．76 g/kg，全氮 0．77 g/kg，全磷 0．65 g/kg，全鉀 13．37 g/kg，堿解氮 39．92 mg/kg，有效磷 9．81 mg/kg，速效鉀 240．01 mg/kg。采取土壤后風干，揀去根系和石礫等雜物，過0．5 cm篩備用。

1．2 試驗設計

試驗于2011年在西南大學農場網室中進行。采用直徑×高=30 cm×40 cm的聚乙烯塑料盆，每盆裝風干土15．0 kg。適時播種，幼苗株高20 cm左右移栽(5月5日)，每盆1株。設置4種施肥處理:不施肥 (CK);無機肥(CF);有機肥(M);有機無機配施 (CFM)。每處理重復9次，共36盆。參考大田生產實際［12］，每盆均施用2．22 g純氮，N∶P2O5∶K2O=1∶1∶1，分別由腐熟干基豬糞、尿素、NaH2PO4·2H2O和 K2SO4提供。其中豬糞氮、磷和鉀含量分別為24．99，6．57，16．85 g/kg。CFM處理以氮素用量的50%折算，即每盆施有機肥49．59 g，M處理每盆施有機肥99．17 g，CFM和M處理不足的 N、P、K用 CO(NH2)2、NaH2PO4·2H2O和 K2SO4補充。在施肥時，磷、鉀肥和有機肥全做基肥，2/3氮肥做基肥，肥土混勻，另1/3氮肥移栽后30 d追施。

1．3 樣品采集

在黃花蒿現蕾期分別采集根、莖、葉植株樣品，105℃殺青，室內自然陰干，稱重，取少量樣品經70℃烘干測水分系數，干重乘以水分系數為生物量(產量)，其余樣品經粉碎過0．42 mm篩，備測有關項目。

1．4 抗瘧相關成分的提取

抗瘧成分提取參照Jessing等［13］的方法，略有改動，精密稱取250 mg樣品粉末，置100 mL磨口帶塞三角瓶中，加入25 mL無水乙醇，稱重，在25℃下，避光，培養箱中振蕩，121 r/min振蕩20 h，無水乙醇補足損失重量，過濾，將濾液密封于 －18℃保存，備測 1．5．2、1．5．3 和1．5．4 項。

1．5 測定項目與方法

1．5．1 土壤與肥料基本化學性質測定 土壤、肥料基本理化性質的測定按常規分析方法［14-15］。土壤有機質采用濃硫酸(H2SO4)重鉻酸鉀(K4CrO4)氧化法;全氮采用凱氏定氮法;全磷采用 NaOH熔融鉬銻抗比色法;全鉀采用NaOH熔融火焰光度法;速效磷采用0．03 mol/L NH4F和0．025 mol/L HCl聯合浸提鉬藍比色法;堿解氮采用1 mol/L NaOH堿解擴散法;土壤速效鉀采用1 mol/L乙酸銨(NH4OAc)浸提火焰光度法測定。

1．5．2 青蒿酸、去氧青蒿素及青蒿素的分析 參照文獻［16］，用 GC－MS分析青蒿酸、去氧青蒿素及青蒿素的含量。分析條件，色譜柱:DB-5 MS(30 m×0．25 mm×0．25μm);升溫程序:50～220℃ (15℃/min，保持5 min);220～230℃ (15℃ /min，保持10 min)，載氣:氦氣 (恒流，31．4 cm/s);分流比:10∶1;檢測器溫度:250℃;離子源溫度:250℃，標準品由Sigma公司提供。青蒿酸、去氧青蒿素及青蒿素的累積量等于青蒿酸、去氧青蒿素及青蒿素的含量乘以生物量(干物重)。

1．5．3 總黃酮測定 根據 NaNO2-Al(NO3)3-NaOH與黃酮形成絡合物的原理，用 Sigma公司提供的蘆丁作對照，在510 nm比色測總黃酮含量［1］。將總黃酮的含量乘以黃花蒿干物重為總黃酮的累積量。

1．5．4 抗氧化活性測定 根據抗氧化活性成分能清除 1，1-二苯基苦基苯肼(1，1-dipheny-l，2-picrylhyrazyl，DPPH)的原理，參照文獻測定黃花蒿抗氧化活性［17-18］，用無水乙醇作試劑配制36．4μg/mL的DPPH溶液。在517 nm處分別測定其吸光值。按如下公式計算清除率:清除率(%)={［1－(Ai－Aj)］/A0}×100(Aj是為了消除浸提液顏色的干擾)。式中，Ai為1 mL供試樣品與4 mLDPPH溶液的吸光度;A0為4mL DPPH溶液和1 mL 80%乙醇的吸光度;Aj為1 mL供試樣品與4 mL 80%乙醇的吸光度。

1．6 數據分析

采用Excel 2007(12．0)軟件和SPSS 10．0軟件對試驗數據進行統計分析，圖表中的數據均為9次重復的平均值，采用單因子方差分析(ANOVA)和LSD法檢驗不同處理間的差異顯著性。

2 結果與分析

2．1 施肥方式對生物量的影響

圖1 施肥對黃花蒿生長的影響Fig．1 Effects of fertilization on biomass of A．annua

圖1可見，施肥顯著促進黃花蒿生長，提高生物量，與以往的研究結果一致［11-12，19-20］。在施用CF、M和CFM的處理中，單株總生物量分別比不施肥增加了57．4%，91．6%和 92．3%。此外，在各處理之間，根系生物量差異不顯著，CFM和M的莖葉生物量顯著高于CF，說明施用有機肥的效果優于化肥。因此，在黃花蒿種植實踐中，提倡施用有機肥對于促進生長很必要。

2．2 抗瘧相關成分含量及累積量對施肥方式的響應

表1是青蒿酸、去氧青蒿素、青蒿素和總黃酮在黃花蒿根、莖、葉中的含量和積累量。

青蒿酸:青蒿酸的含量分布因器官不同而異，葉片最高，其含量和累積量平均分別為 7733．60 mg/kg和 236．67 mg/株;莖其次，分別是 162．88 mg/kg 和 8．76 mg/株;根系最低，僅 79．33 mg/kg 和 1．26 mg/株，說明葉片是青蒿酸合成和儲存的主要器官。

施肥顯著提高青蒿酸的含量。施肥后，葉片中的青蒿酸含量增加1．21～2．25倍，CFM和M處理顯著高于CK;莖中的增加1．10～2．65倍，增幅表現出CFM＞CF＞M的趨勢;根系中的增加1．35～2．85倍，增加趨勢與莖相同。

表1 施肥方式對黃花蒿各器官抗瘧成分含量和積累量的影響Table 1 Influence of fertilization on concentration and accumulation of antimalarial com ponents in different organs of A．annua

不施肥處理青蒿酸的累積量最低，施肥使整株青蒿酸累積量增加2．48～5．94倍。其中，葉片增加2．40～5．71倍;莖增加1．85～5．64倍;根系中的增加1．73～3．13倍;青蒿酸的增幅均以CFM處理最為顯著。說明施肥尤其是CFM有利于提高青蒿酸的產量。

去氧青蒿素:在黃花蒿各器官中，去氧青蒿素含量和累積量均為葉片最高，平均值分別是456．98 mg/kg和13．38 mg/株;莖次之，為19．84 mg/kg 和 1．02 mg/株;根系最低，僅為5．07 mg/kg 和0．08 mg/株。由此可見去氧青蒿素主要分配于葉片。

施肥對去氧青蒿素含量的影響因器官不同而異，施肥總體上提高了各器官中的去氧青蒿素含量。與不施肥處理相比，葉片中去氧青蒿素含量提高 1．38～1．25倍;莖中的提高 2．90～3．75倍，根系中的提高 3．58～4．95倍;在CFM和M處理中，葉片和根系中去氧青蒿素含量均顯著高于CF。說明施用有機肥有利于提高去氧青蒿素含量。

施肥促進去氧青蒿素累積，整株累積量增加 2．48～4．02倍，其中葉片增加 2．35～3．96倍，莖增加 5．22～7．5倍，根系中增加4．53～5．57倍。整株和葉片中的去氧青蒿素累積量M＞CFM＞CF;根莖中的去氧青蒿素累積量以CFM處理最高。說明施用有機肥有利于提高去氧青蒿素的產量。

青蒿素:在黃花蒿各器官中，青蒿素含量和累積量均以葉片最高，平均值分別為13424．39 mg/kg和394．83 mg/株;莖次之，為 507．00 mg/kg 和 27．24 mg/株;根系最低，僅 77．53 mg/kg 和 1．24 mg/株。說明葉片是青蒿素主要合成和儲存器官。

不施肥處理的青蒿素含量最低，施肥后顯著提高青蒿素含量，其中葉片中的青蒿素含量提高1．18～1．39倍，莖中提高2．81～3．06倍;根系中增加1．00～2．02倍。各器官的青蒿素含量表現出CFM＞M＞CF的趨勢，其中CFM和M差異不顯著，但均顯著高于CF。說明CFM和M有利于提高黃花蒿的青蒿素含量。

青蒿素累積量因器官不同而異，不施肥最低，施肥后顯著提高，整個植株的增幅為2．43～4．01倍，其中葉片為 2．35 ～3．95倍;莖4．27 ～6．15倍;根系1．28 ～2．57 倍。各器官的青蒿素含量表現出M ＞CFM ＞CF，其中CFM和M差異不顯著，但顯著高于CF。說明施肥尤其是施用有機肥顯著提高青蒿素產量。

總黃酮:黃花蒿不同器官的總黃酮含量也不一樣。其中，葉片最高，根系次之，莖最低，葉片中的總黃酮含量是根莖的3．64～5．25倍，類似青蒿素。說明黃花蒿葉片是積累或合成黃酮的主要器官。因此，在提取黃花蒿葉片青蒿素的同時也可提取黃酮。

圖2 施肥對黃花蒿抗氧化活性的影響Fig．2 Antioxidant activities of A．annua under different fertilization

施肥對總黃酮含量的影響因器官不同而異。施肥總體上對葉片總黃酮含量無顯著影響，但顯著提高莖中的總黃酮含量，根系總黃酮含量則降低。

施肥顯著提高黃花蒿總黃酮積累量，尤以CFM處理最為顯著，單株總黃酮積累量分別比不施肥(對照)提高了 72．48%(CFM)、66．90%(M)和54．65%(CF)。因此，黃花蒿種植過程中，施用有機肥及有機無機配施可提高總黃酮的產量。

2．3 抗氧化活性對施肥方式的響應

圖2可見，在黃花蒿體內，各器官的乙醇提取液對DPPH·清除率表現為:葉片＞根系＞莖，平均值依次為65．05%，45．15%和40．08%。說明黃花蒿葉片的抗氧化能力最強，顯著高于根系和莖，但后二者之間差異不顯著。此外，在不施肥的處理中，各器官乙醇提取液對DPPH·清除率最高，施肥后不同程度降低，類似施肥對菊花抗氧化活性成分的影響［21］。在施肥處理中，葉片的抗氧化活性在CFM顯著高于CF和M，后二者的差異不顯著。

2．4 黃花蒿抗瘧相關成分及抗氧化活性的相關性

相關分析表明，青蒿酸、去氧青蒿素、青蒿素的含量之間分別呈極顯著正相關 (P＜0．01)，但這3種成分與總黃酮及DPPH·清除率無顯著相關(表2)。在黃花蒿體內，總黃酮含量與抗氧化活性呈顯著正相關，可用回歸方程 y=9．2096x+35．447(r=0．4924*，n=36)表示二者的關系，其中y為DPPH·清除率，x為總黃酮含量(表2、圖3)。

表2 抗瘧相關成分及抗氧化活性的相關性分析(n=36)Table 2 Correlation between antimalarial compounds and antioxidants in A．annua(n=36)

圖3 黃花蒿總黃酮與抗氧化活性的回歸分析(n=108)Fig．3 Regression analyses of total flavonoids and antioxidant in A．annua(n=108)

3 討論

采集不同海拔的黃花蒿葉片，用GC－MS均能同時檢測到青蒿酸、去氧青蒿素和青蒿素3種抗瘧相關成分［16］。論文進一步研究了上述成分、總黃酮和抗氧化活性在植株體內的含量分布，以及施肥對它們的影響。結果表明，在葉片中的青蒿酸、去氧青蒿素、青蒿素、總黃酮含量和抗氧化活性最高，莖次之，根系最低。說明葉片是合成和儲存上述成分的主要器官，是藥用重要部位。

施肥促進黃花蒿的生長，單株生物產量比不施肥顯著增加。在施肥處理中。CFM和M處理的生物量顯著高于 CF，類似前人研究結果［11-12，19-20］。同時，施肥顯著提高青蒿酸、去氧青蒿素、青蒿素的含量和產量，盡管施肥總體上對葉片總黃酮含量無顯著影響，根系總黃酮含量降低，但顯著提高黃花蒿生物量，故黃花蒿總黃酮產量仍然顯著增加。需要指出的是，CFM和M處理的抗瘧成分產量顯著高于CF。因此，在人工種植黃花蒿的過程中，施用有機肥可提高抗瘧成分產量。此外，相對于其他抗瘧成分，黃花蒿的莖含有較高的黃酮，僅次于葉，變化于590．57～814．24 mg/kg之間。目前，對黃花蒿莖的利用較少，往往丟棄在田間地頭［22］，建議將其粉碎加入反芻動物的飼料中，有益于動物健康，減少抗生素使用［8］。

在不施肥的處理中，總黃酮含量及DPPH·清除率最高(莖的總黃酮含量除外)，施肥后不同程度降低。其原因可能是在缺肥條件下，黃花蒿產生了一系列應急反應，根系釋放出大量的含有酚羥基的黃酮類，活化土壤中的礦質養分，如P，K，Fe等，提高它們的生物有效性［23］。另一方面，有些黃酮成分具有抗菌和殺蟲作用，有利于提高黃花蒿植株自身免疫力［24］。

統計分析表明，在黃花蒿植株體內，青蒿酸、去氧青蒿素、青蒿素之間分別呈極顯著正相關 (P＜0．01)，相關系數分別為0．972＊＊，0．959＊＊和0．998＊＊(n=36)。其原因可解釋為它們有共同的生源途徑，青蒿酸是青蒿素的合成前體［4］，去氧青蒿素是青蒿素的代謝產物［6］。但是，青蒿酸、去氧青蒿素、青蒿素與DPPH·清除率無顯著相關，說明這些抗瘧成分沒有清除DPPH·的作用。在黃花蒿體內，總黃酮含量與DPPH·清除率呈顯著正相關，類似菊花體內總黃酮含量與抗氧化活性的關系［21］，說明黃花蒿的總黃酮具有抗氧化活性。黃花蒿含有40多種黃酮類物質，如貓野草酚、貓野草黃素、紫花牡丹素及蒿黃素等。在它們的分子結構中，大多數芳香環上有羥基，由于共軛作用，羥基的電子向芳香環偏轉，使之具有較低的氧化還原電位，容易接受電子清除O2－·，產生抗氧化作用，故總黃酮含量與抗氧化活性呈顯著正相關［7-8］。

4 結論

在黃花蒿體內，青蒿酸、去氧青蒿素、青蒿素及總黃酮等抗瘧成分在葉片中的含量最高，說明葉片是合成和儲存這些抗瘧成分的主要器官。青蒿酸、去氧青蒿素及青蒿素之間分別呈極顯著正相關，總黃酮與DPPH·清除率呈顯著正相關。

施肥促進黃花蒿生長，提高青蒿酸、去氧青蒿素和青蒿素等抗瘧成分的含量，但總體上對黃酮含量的影響不大，抗氧化活性則有所降低。

施肥顯著提高黃花蒿青蒿酸、去氧青蒿素及青蒿素的產量，尤以有機無機配施和施用有機肥最為顯著。因此，在集約化種植黃花蒿的過程中，提倡施用有機肥很有必要。

［1］中國藥典．一部［S］．2010:184．

［2］Bhakuni R S，Jain D C，Sharma R P，et al．Secondarymetabolites of Artemisia annua and their biological activity［J］．Current Science，2001，80(1):35-48．

［3］World Health Organization．World Malaria Report2010(WHO，Geneva，2010)［R］．2010:28．

［4］Francois L，Peter H S．Continuous-flow synthesis of the anti-malaria drug artemisinin［J］．Angewandte Chemie International Edition，2012，51(7):1706-1709．

［5］Dhingra V，Pakki SR，Narasu M L，Antimicrobial activity of artemisinin and its precursors［J］．Current Science，2000，78(6):708-710．

［6］占紀勛，魏秋棼，單成啟，等．四個青蒿素生物轉化產物抗體外培養惡性瘧原蟲活性研究［J］．中國熱帶醫學，2003，3(1):17-20．

［7］Jorge FS，Devanand L，Tomikazu S，etal．Flavonoids from Artemisia annua L．as antioxidants and their potential synergism with artemisinin against nalaria and cancer［J］．Molecules，2010，15(5):3135-3170．

［8］Ebiamadon A B，Umoren E U，Brisibe F，et al．Nutritional characterisation and antioxidant capacity of different tissues of Artemisia annua L［J］．Food Chemistry，2009，115(4):1240-1246．

［9］劉秋文，趙金玲，陳金娥．干、鮮青蒿葉中活性成分含量及抗氧化性對比研究［J］．中國食品工業，2011，7:63-65．

［10］郭紅斌，弓素梅．青蒿素與青蒿水提液對感染柔嫩艾美耳球蟲肉雞的療效評價［J］．動物醫學進展，2011，32(3):82-85．

［11］王滿蓮，蔣運生，韋霄，等．栽培密度和施肥水平對黃花蒿生長特性和青蒿素的影響［J］．植物營養與肥料學報，2010，16(1):185-190．

［12］韋中強，李成東，肖杰易，等．施肥水平對青蒿產量和質量影響的研究［J］．時珍國醫國藥，2008，19(5):1286-1287．

［13］Jessing K K，Cedergreen N，Jensen J，etal．Degradation and ecotoxicity of the biomedical drug artemisinin in soil［J］．Environment Toxicology and Chemistry，2009，28(4):701-710．

［14］鮑士旦．土壤農化分析(第三版)［M］．北京:中國農業出版社，2005．

［15］單貴蓮，初曉輝，田青松，等．典型草原恢復演替過程中土壤性狀動態變化研究［J］．草業學報，2012，21(4):1-9．

［16］余正文．青蒿抗瘧化合物代謝積累及其相關性研究［D］．重慶:重慶大學，2010．

［17］Von Gadow A，Joubert E，Hansmann C F．Comparison of the antioxidantactivity of rooibos tea(Aspalatlms linearis)with green，oolong and black tea［J］．Food Chemistry，1997，61(1):73-77．

［18］何全磊，苗芳，李春玲，等．毛細辛提取物體外抗氧化活性研究［J］．草業學報，2012，21(5):285-290．

［19］錢永生，朱江敏，吳劍丙，等．施肥對溝葉結縷草生長及生理特性的影響［J］．草業學報，2012，21(3):234-241．

［20］楊水平，楊憲，黃建國，等．氮磷鉀肥和密度對青蒿生長和青蒿素產量的影響［J］．中國中藥雜志，2009，34(17):47-52．

［21］劉大會，劉偉，朱瑞衛，等．使用磷肥對菊花活性成分及清除能力的影響［J］．中國中藥雜志，2010，35(17):2236-2241．

［22］Bilia A R，Magalh es PM，BergonziM C，et al．Simultaneous analysis of artemisinin and flavonoids of several extracts of Artemisia annua L．obtained from a commercial sample and a selected cultivar［J］．Phytomedicine，2006，13(7):487-493．

［23］Bais H P，Weir T L，Perry LG，etal．The role of rootexudates in rhizosphere interactionswith plants and other organisms［J］．Annual Review Plant Biology，2006，57:233-266．

［24］Koeppe E E，Southwick L M．The relationship of tissue chlorogenic acid concentration and leaching of phenolics from sunflowers grown under varying phosphates nutrient condition［J］．Canadian Journal of Botany，1976，54(7):593-599．