1，3-β-D-葡聚糖和抗白念珠菌芽管抗體檢測(cè)對(duì)侵襲性念珠菌病診斷的臨床價(jià)值

何力志，石國(guó)民，胡方興

(1.湖南省第二人民醫(yī)院，湖南長(zhǎng)沙410007;2.長(zhǎng)沙市中心醫(yī)院，湖南長(zhǎng)沙410004;3.長(zhǎng)沙市第三醫(yī)院，湖南長(zhǎng)沙410015)

隨著廣譜抗菌藥物、免疫抑制劑及抗腫瘤藥物等的廣泛應(yīng)用，侵襲性念珠菌病(invasive candidiasis，IC)的發(fā)病率逐年升高，病死率高達(dá)49%[1]。大量的臨床資料表明，IC的轉(zhuǎn)歸很大程度取決于早期診治，而現(xiàn)有的IC診斷指標(biāo)存在一定的局限性[2]。近年研究發(fā)現(xiàn)侵襲性真菌感染后人體內(nèi)可以檢測(cè)到一些特異性抗原或抗體成分。抗白念珠菌芽管抗體(anti-Candida albicans germ tube antibody，CAGTA)是一種保護(hù)性抗體，早期檢測(cè)有助于 IC 的診斷[3]，而1，3-β-D-葡聚糖(1，3-beta-D-glucan，BG)作為一種廣譜真菌標(biāo)志物，對(duì)診斷IC的特異性和陽(yáng)性預(yù)測(cè)值較高，但有一定假陽(yáng)性[4]。因此，我們對(duì)BG和抗CAGTA進(jìn)行聯(lián)合檢測(cè)，以探討其對(duì)IC的診斷和治療監(jiān)測(cè)的價(jià)值。

材料和方法

一、研究對(duì)象

收集2011年6月至2012年6月湖南省第二人民醫(yī)院、長(zhǎng)沙市中心醫(yī)院及長(zhǎng)沙市第三醫(yī)院血液科、呼吸科、重癥監(jiān)護(hù)病房(intensive care unit，ICU)、腫瘤科、腎內(nèi)科、老年科、兒科等疑診為IC的病例252例，其中男162例，女90例。IC診斷標(biāo)準(zhǔn):按歐洲癌癥治療研究組織(European Organization for Research on Treatment of Cancer，EORTC)和美國(guó)國(guó)立變態(tài)反應(yīng)與傳染病研究所霉菌病研究組(the United States National Institute of Allergy and Infectious Disease Research Institute Mycoses Study Group，NIAID-MSG)2007 年修訂的侵襲性真菌病(invasive fungal disease，IFD)診斷標(biāo)準(zhǔn)及國(guó)內(nèi)相關(guān)學(xué)會(huì)制定的各科侵襲性真菌感染(invasive fungal infection，IFI)診治指南，參照文獻(xiàn)[5]，將IC診斷分為確診、臨床診斷、擬診及排除IC。符合以上確診或臨床診斷的患者為感染組(陽(yáng)性者培養(yǎng)鑒定均為念珠菌)。定植組:為無(wú)深部真菌感染的基礎(chǔ)疾病或臨床表現(xiàn)的門(mén)診體檢者，每人的痰、糞、尿標(biāo)本多次涂片鏡檢均未見(jiàn)菌絲或孢子，其中單一標(biāo)本培養(yǎng)鑒定為念珠菌。

二、標(biāo)本采集

每個(gè)疑診為IC的患者均進(jìn)行影像學(xué)檢查、病原學(xué)檢查(血培養(yǎng)、痰培養(yǎng)、痰真菌涂片);部分患者行纖維支氣管鏡檢查，收集支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BAL)進(jìn)行病原菌培養(yǎng)，以及經(jīng)支氣管肺活檢或計(jì)算機(jī)斷層掃描引導(dǎo)下肺穿刺行組織培養(yǎng)或病理學(xué)檢查，特殊患者留取腹腔和胸腔積液做真菌培養(yǎng)。定植組收集痰、糞、尿標(biāo)本做直接鏡檢和培養(yǎng)。感染組患者在第1周靜脈采血2次，以后每周采血1次，全部患者連續(xù)監(jiān)測(cè)的時(shí)間為4周～2個(gè)月，或至患者死亡，或排除IC診斷為止。定植組患者采血次數(shù)同上。每個(gè)患者分別采取血清和肝素抗凝的血漿標(biāo)本各2 mL，分離血清或血漿，凍存于-70℃冰箱備檢。分離菌株常溫保存。

三、抗真菌治療

感染組患者給予廣譜抗真菌治療，在接受治療2周后評(píng)價(jià)臨床癥狀、體征、放射學(xué)、病原學(xué)改變以及療效。

四、試劑與儀器

所用的API20C-AUX鑒定試劑、沙堡羅培養(yǎng)基均為法國(guó)梅里埃公司產(chǎn)品;MB-80微生物動(dòng)態(tài)快速檢測(cè)系統(tǒng)、T01智能恒溫儀、冰浴槽以及GKT-5M Set動(dòng)態(tài)真菌檢測(cè)試劑盒均為北京金山川科技發(fā)展公司產(chǎn)品。兔抗人多克隆IgG/異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC)抗體為Sigma公司產(chǎn)品。

五、血BG檢測(cè)

取感染組和定植組的待檢血漿進(jìn)行BG檢測(cè)，具體操作嚴(yán)格按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。廠家提供的對(duì)照血漿中真菌BG＜10 ng/L為正常，10～50 ng/L為可疑，≥50 ng/L為陽(yáng)性。

六、間接免疫熒光法檢測(cè)抗CAGTA

首先制作具有芽管抗原的載玻片，然后制備孢子懸液，用于吸附感染組和定植組待檢血請(qǐng)中的孢子抗體。血清吸附后，再采用間接免疫熒光試驗(yàn)檢測(cè)抗CAGTA。結(jié)果判定和具體操作參照文獻(xiàn)[6]進(jìn)行。

七、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。以感染組為真陽(yáng)性，定植組為真陰性作四格表，分析評(píng)價(jià)抗CAGTA試驗(yàn)和BG單獨(dú)以及二者聯(lián)合應(yīng)用后診斷IC的敏感性、特異性、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值及陰性預(yù)測(cè)值。率的比較采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、病例資料

確診為IC患者5例，臨床診斷為IC患者21例，感染組共計(jì)26例。定植組100例。

二、BG結(jié)果分析

確診為IC的5例患者BG均為陽(yáng)性，臨床診斷為IC的21例患者中有11例BG為陽(yáng)性。100例定植組中有10例BG陽(yáng)性。BG對(duì)IC診斷的敏感性、特異性、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值分別為61.5%、90.0%、61.5%、90.0%。

三、抗CAGTA結(jié)果分析

確診為IC的5例患者抗CAGTA均為陽(yáng)性，臨床診斷為IC的21例患者中有10例抗CAGTA為陽(yáng)性。100例定植組中有17例抗CAGTA陽(yáng)性?？笴AGTA對(duì)IC診斷的敏感性、特異性、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值分別為 57.7%、83.0%、46.9%、88.3%。

四、BG和抗CAGTA聯(lián)合檢測(cè)的診斷能力

感染組抗CAGTA陽(yáng)性15例、BG陽(yáng)性16例，其中14例為同一患者。當(dāng)BG和抗CAGTA同時(shí)陽(yáng)性時(shí)，2組試驗(yàn)數(shù)據(jù)的動(dòng)力學(xué)變化相一致。

當(dāng)定植組抗CAGTA或BG出現(xiàn)陽(yáng)性時(shí)，會(huì)出現(xiàn)抗GAGTA或BG含量突然上升的現(xiàn)象，然后隨著病程的推移，未經(jīng)抗真菌治療自動(dòng)轉(zhuǎn)陰，見(jiàn)圖1、2。另外定植組無(wú)患者抗CAGTA和BG同時(shí)陽(yáng)性，二者之間無(wú)對(duì)應(yīng)性。

BG和抗CAGTA聯(lián)合檢測(cè)對(duì)IC診斷的敏感性、特異性、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值分別為53.8%、100.0%、100.0%、89.3%，與單項(xiàng)檢測(cè)相比，敏感性、陰性預(yù)測(cè)值差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，但特異性和陽(yáng)性預(yù)測(cè)值均明顯提高(P ＜0.05)，均達(dá)100.0%。

圖1 定植組BG陽(yáng)性時(shí)平均BG值變化

圖2 定植組抗CAGTA陽(yáng)性時(shí)平均抗體值變化

五、抗真菌治療療效與抗CAGTA和BG含量變化的關(guān)系

感染組BG陽(yáng)性16例，在接受抗真菌治療后，14例有效，2例無(wú)效。以采血時(shí)間第1、8、12、16、20、24、28、32、36、40 天各檢測(cè)點(diǎn)平均 BG 含量作圖，其變化趨勢(shì)見(jiàn)圖3。治療無(wú)效組BG值總體呈上升趨勢(shì);治療有效組BG含量均值呈下降趨勢(shì)，最后達(dá)到正常。感染組抗CAGTA陽(yáng)性15例，在接受抗真菌治療后，13例有效，2例無(wú)效。以各檢測(cè)點(diǎn)平均抗CAGTA含量作圖，其變化趨勢(shì)見(jiàn)圖4。從圖3、4可以看出，感染組抗真菌治療后，抗CAGTA與BG動(dòng)力學(xué)變化規(guī)律一致。同時(shí)，結(jié)合臨床資料顯示，BG(第8天)和抗CAGTA(第12天)已開(kāi)始呈現(xiàn)陽(yáng)性，早于臨床抗真菌治療。

圖3 治療有效組與無(wú)效組的平均BG含量變化

圖4 治療有效組與無(wú)效組的平均抗CAGTA含量變化

討 論

IFI時(shí)，BG可從真菌細(xì)胞壁釋入血中，而淺表感染或定植時(shí)BG極少釋放入血。因此在人體液和組織中檢測(cè)到BG往往提示IFI[7]。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)BG的研究較多，其對(duì)IC的診斷作用日益明確。在EORTC/NIAID-MSG診斷IFD的標(biāo)準(zhǔn)中已將BG連續(xù)2次陽(yáng)性作為陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)。本研究結(jié)果顯示BG對(duì)IC診斷的敏感性、特異性、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值分別為 61.5%、90.0%、61.5%、90.0%。與 kondori等[8]的研究結(jié)果(BG 檢測(cè)的敏感性為70% ～100%、特異性為87% ～96%)有一定差距，但與武建國(guó)等[6]的報(bào)道(敏感性為63.6%、特異性為 90.8%)相近，可能由于所使用試劑盒及病例等不同所致。上述研究結(jié)果顯示BG診斷IC仍有一定的假陽(yáng)性。據(jù)報(bào)道，菌血癥患者的假陽(yáng)性率約60%，革蘭陽(yáng)性球菌菌血癥高達(dá)73%[9]。其他引起假陽(yáng)性的原因還包括:溶血、γ球蛋白或凝血因子、某些藥物干擾、血液透析用纖維素膜、暴露于含葡聚糖的面繃帶、中暑及其他未知原因等。

白念珠菌由酵母相轉(zhuǎn)變?yōu)榫z相過(guò)程中形成芽管。西班牙科學(xué)家首先在播散性白念珠菌患者的血清中檢測(cè)到芽管抗體，并證實(shí)了人們提出的芽管是白念珠菌由定植菌向致病菌轉(zhuǎn)變的標(biāo)志。抗CAGTA診斷IC的總體敏感性為77%～89%，特異性為91% ～100%[10];在其他念珠菌如熱帶念珠菌、光滑念珠菌、近平滑念珠菌等引起的侵襲性感染中也可呈現(xiàn)陽(yáng)性反應(yīng)[11]。盡管學(xué)者們對(duì)檢測(cè)抗體診斷IC一直存在疑慮:認(rèn)為免疫功能受到抑制的患者可能檢測(cè)不出相應(yīng)抗體，另外抗體陽(yáng)性患者需排除真菌在體內(nèi)定植。但最近也有文獻(xiàn)報(bào)道，免疫功能低下家兔Western blot條帶多于免疫功能正常的家兔，其原因可能為前者的抗原清除能力減弱，反而刺激機(jī)體產(chǎn)生相應(yīng)的抗體[12]。另有文獻(xiàn)報(bào)道，免疫功能低下的SC家兔產(chǎn)生抗烯醇化酶抗體的能力與免疫功能正常的SC家兔相似[13]。本研究結(jié)果顯示，免疫功能低下患者依然能產(chǎn)生抗體，抗CAGTA對(duì)IC診斷的敏感性、特異性、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值分別達(dá)57.7%、83.0%、46.9%、88.3%。

本研究對(duì)BG和抗CAGTA進(jìn)行聯(lián)合檢測(cè)，結(jié)果表明感染組中抗CAGTA陽(yáng)性15例、BG陽(yáng)性16例，其中14例為同一患者。定植組無(wú)一例患者抗CAGTA和BG同時(shí)陽(yáng)性，二者之間無(wú)對(duì)應(yīng)性;而且當(dāng)抗CAGTA或BG陽(yáng)性時(shí)，會(huì)出現(xiàn)二者含量突然上升，沒(méi)有經(jīng)抗真菌治療，隨病程推移自動(dòng)轉(zhuǎn)陰的現(xiàn)象。這種差異具有重要意義，借此可以排除IC診斷的假陽(yáng)性。BG和抗CAGTA聯(lián)合檢測(cè)診斷IC的敏感性、陰性預(yù)測(cè)值與單項(xiàng)檢測(cè)相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，但特異性和陽(yáng)性預(yù)測(cè)值明顯提高(P＜0.05)，分別達(dá)100.0%。這說(shuō)明 BG和抗CAGTA聯(lián)合檢測(cè)明顯優(yōu)于單項(xiàng)檢測(cè)。

從圖3和圖4并結(jié)合臨床資料可以發(fā)現(xiàn)，在對(duì)感染組進(jìn)行抗真菌治療前，BG(第8天)和抗CAGTA(第12天)已經(jīng)是陽(yáng)性了。治療有效組隨著抗真菌治療時(shí)間的延長(zhǎng)，BG和抗CAGTA含量逐漸下降;治療無(wú)效組BG和抗CAGTA含量呈持續(xù)上升趨勢(shì)。這說(shuō)明動(dòng)態(tài)檢測(cè)BG和抗CAGTA含量對(duì)臨床療效觀察和早期診斷具有一定意義，但具體應(yīng)用價(jià)值仍待進(jìn)一步研究。

綜上所述，聯(lián)合監(jiān)測(cè)BG和抗CAGTA不僅能提高IC診斷的特異性和陽(yáng)性預(yù)測(cè)值，而且對(duì)IC的早期診斷和治療監(jiān)測(cè)具有潛在應(yīng)用價(jià)值;同時(shí)也為實(shí)驗(yàn)室無(wú)創(chuàng)、快速和特異地鑒定IC病原體提供了科學(xué)依據(jù)。

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