HbA1c在三種檢測系統及不同儲存條件下結果的穩定性

索明環， 溫冬梅， 張秀明， 周甲思， 陳亞瓊， 吳劍楊， 徐全中， 胡 婷， 闞麗娟

(中山大學附屬中山醫院檢驗中心，廣東中山528403)

糖化血紅蛋白A1c(glycosylated hemoglobin A1c，HbA1c)是糖尿病診斷和并發癥控制的金標準。2010年美國糖尿病協會(American Diabetes Association，ADA)將HbA1c列為糖尿病診斷的標準［1］。HbA1c降低可以減少大血管及微血管病變，并且濃度的變化與患者的預后息息相關［2-3］。保證HbA1c檢測結果的準確性對臨床診斷和監測糖尿病至關重要。在我國，某些醫學實驗室還沒有開展這一項目的檢測，且HbA1c的檢測方法眾多，標準化工作剛剛開展［4］。若要推廣HbA1c的檢測，保證標準化計劃順利實施就必須先了解樣本儲存及運送的條件，避免因為分析前因素導致結果的不可比。我們選用了目前醫學實驗室常規使用的3種HbA1c檢測系統，通過對樣本不同存放溫度及時間的限制，了解樣本的儲存條件及穩定性，為醫學實驗室規范開展HbA1c檢測和標準化計劃及科學研究提供參考依據。

材料和方法

一、檢測系統

1.陽離子離子交換高效液相色譜法(HPLC)

采用Bio-Rad variantⅡTurbo糖化血紅蛋白檢測儀(簡稱Bio-Rad variantⅡTurbo)。應用配套的試劑、校準品、防護柱、分析柱及質控品。按廠家要求400個測試更換防護柱，2 000個測試更換分析柱，更換柱子后按要求進行活化定標。

2.親和層析HPLC 采用Primus Ultra2糖化血紅蛋白檢測儀(簡稱Primus Ultra2)及配套試劑、分析柱。校準品及質控品為Bio-Rad公司產品。按要求反轉更換柱子，定期做酶清洗。

3.免疫抑制比濁法 應用Roche Modular PPI全自動生化分析儀(簡稱Roche Modular PPI)及配套HbA1c測定試劑、校準品及質控品。

二、穩定性評價

根據美國糖化血紅蛋白標準化計劃(National Glycohemoglobin Standardization Program，NGSP)儲存校準品及質控品的穩定性標準，進行全血樣本的穩定性評價。NGSP規定:HbA1c測定結果以－70℃或更低溫度±3s為可接受范圍，在±3s范圍內結果穩定，否則為不穩定［5］。

三、樣本的制備

1.選取當日用Bio-Rad variantⅡTurbo檢測系統檢測的分布范圍為6.0%～7.0%、9.0%～10.0%及11.0%～12.0%的乙二胺四乙酸二鉀(EDTA-K2)抗凝全血樣本各5支，觀察每支樣本的檢測結果分析圖譜，摒棄存在異常圖譜的樣本。

2.檢測選取的全血樣本的平均紅細胞體積和平均紅細胞血紅蛋白濃度，同時用法國Sebia Capillary 2毛細管電泳儀檢測，排除地中海貧血和異常血紅蛋白樣本。

3.最終選定3支樣本，本實驗室 Bio-Rad variantⅡTurbo檢測結果分別為6.2%(樣本1)、9.3%(樣本 2)、11.1%(樣本 3)。收集同一患者同一時間抽取的EDTA-K2抗凝血，混合后分裝，每管50μL。分別置于常溫(20～25℃)、4℃、－30 ℃、－70 ℃保存，分別于第 1、3、5、7、14、21、28、35、42、56、84 天用 3 種檢測系統檢測，同一樣本同一時間每個檢測系統各檢測2次，取平均值作為評價結果。

結 果

一、－70℃保存條件下樣本的測定結果

－70℃保存條件下3種檢測系統的結果顯示出很好的穩定性。其中Bio-Rad variantⅡTurbo測定樣本的變異系數(CV)為2.12%～2.80%;Primus Ultra2的 CV為2.19%～2.71%;Roche Modular PPI的 CV為2.28%～2.91%。Bio-Rad variantⅡTurbo樣本1結果的穩定性范圍為5.97%～7.00%、樣本 2為8.78%～9.98%、樣本3為10.48%～12.41%。Primus Ultra2樣本1結果的穩定性范圍為6.06%～7.14%、樣本2為8.81%～10.41%、樣本 3為10.50%～11.97%。Roche Modular PPI樣本1結果的穩定性范圍為5.96%～7.10%、樣本 2為8.88%～10.20%，樣本3為10.86%～12.45%。見圖1、表1。

圖1 －70℃保存樣本的穩定性

二、不同存放溫度、不同時間、不同濃度、不同儀器樣本的穩定性結果的判斷

以表1所列的穩定性范圍作為判斷標準。當結果超出穩定性范圍時，則穩定時間以上一次存儲時間為準。當3個樣本全部滿足穩定性范圍時，則判定該儲存條件可保持樣本穩定。3種檢測系統檢測樣本的穩定性見表2和圖2。

表1 －70℃保存樣本3種檢測系統測定結果的分析與比較 (%)

表2 3種檢測系統HbA1c樣本在不同條件下的穩定性

圖2 3種檢測系統不同條件下樣本的穩定性

1.Bio-Rad variantⅡTurbo 樣本1常溫條件下可穩定7 d、4℃可穩定14 d、－30℃可穩定35 d;樣本2常溫可穩定21 d、4℃可穩定28 d、－30℃可穩定35 d;樣本3常溫可穩定7 d、4℃可穩定14 d、－30℃可穩定42 d。因此，用Bio-Rad variantⅡTurbo測定樣本常溫可穩定 7 d、4℃可穩定14 d、－30℃可穩定35 d。

2.Primus Ultra2樣本1常溫條件下可穩定14 d、4及－30℃均可穩定84 d;樣本2常溫可穩定21 d、4℃可穩定56 d、－30℃可穩定84 d;樣本3常溫可穩定14 d、4℃可穩定56 d，－30℃可穩定84 d。因此，用Primus Ultra2測定樣本常溫可穩定14 d、4℃可穩定56 d、－30℃可穩定84 d。

3.Roche Modular PPI 樣本1常溫條件下可穩定14 d、4及－30℃均可穩定84 d;樣本2常溫可穩定21 d、4及－30℃均可穩定84 d;樣本3常溫可穩定14 d，4及－30℃均可穩定84 d。因此，用Roche Modular PPI測定樣本常溫可穩定14 d、4及－30℃均可穩定84 d。

討 論

HbA1c可反映機體2～3個月的血糖水平，不受患者當天抽血狀態的影響，是評價糖尿病患者血糖控制狀況極有價值的指標。美國ADA已經將其列為診斷糖尿病的標準。而國內還沒有將HbA1c作為診斷標準，主要原因是國內檢測HbA1c的方法眾多，結果差異性較大。這2年國內加快了HbA1c的標準化進程。相信不久的將來，HbA1c也會成為中國糖尿病診斷的標準。但要保證HbA1c檢測的正確性，就要對實驗方法和檢測系統的穩定性非常了解，本研究選用了3個常見的檢測系統進行評價。

本研究選用的穩定性標準是用－70℃測定結果的均值的95%可信區間來判斷。因為很多學者已經證明－70℃下存放的樣本用離子交換HPLC測定至少1年是穩定的［6］，并且－70℃保存樣本也是DCCT參考實驗室和NGSP網絡實驗室采用的保存質控品和校準品的條件［7-8］。故采用此穩定性標準可靠、可行。

本研究中評價了3種不同方法、不同儀器、不同濃度樣本、不同存放條件對檢測結果的干擾，結果確實存在差異。Bio-Rad variantⅡTurbo測定樣本常溫可穩定7 d，4℃可穩定14 d，－30℃可穩定 35 d;而 Little等［8］的結果顯示 Bio-Rad VariantⅡ為常溫7 d、4℃ 57 d、－20℃ 28 d;并且王冬環等［9］檢測結果也顯示東曹G7測定的穩定性為－20℃ 14 d、4℃ 63 d。這3臺儀器均采用離子交換HPLC，4℃穩定性相差較大，這也可能與儀器性能有關。因為Bio-Rad variantⅡTurbo檢測樣本的速度與其他儀器比較提高了許多，但在一定程度上也犧牲了HPLC檢測的穩定性;Primus Ultra2及Roche Modular PPI則顯示出了較好的穩定性，與Little等［8］的檢測結果［Primus CLC(385 and 330)顯示全血穩定性為常溫14 d、4及－20℃ 57 d］一致。但在本研究中2種檢測系統顯示出了更好的穩定性，其中Primus Ultra24℃可穩定56 d、－30℃至少可穩定84 d，Roche Modular PPI 4及－30℃均至少可穩定84 d。這可能與不同的檢測系統及檢測方法有關。親和層析HPLC是以糖基化位點的結構特異性為測定原理。HbA1c可以與親和樹脂連接，而非糖化血紅蛋白不可以，因而被分離。親和層析HPLC不受溫度、氨基甲酰糖化血紅蛋白和胎兒血紅蛋白的干擾，結果可靠。免疫抑制比濁法是依據血紅蛋白上糖化基團的結構特點而設計，原理是根據HbA1c與相應的單抗結合發生凝集反應的特性，受干擾因素也較小。因此，這2種檢測系統顯示出比較好的穩定性。

綜上所述，不同的檢測系統在不同的樣本存放條件下，檢測結果存在差異。實驗室無論檢測常規患者樣本還是做實驗研究，或實驗標準化計劃都應根據實驗要求及檢測系統做好樣本的儲存工作。

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［9］王冬環，張傳寶.全血糖化血紅蛋白用常規方法測定的穩定性研究［J］.中華檢驗醫學雜志，2009，32(10):1178-1182.