耐甲氧西林金黃色葡萄球菌醫院感染爆發流行的實驗室調查

徐偉紅，徐 斌，范列英

(1.同濟大學醫學院，上海200092;2.上海同仁醫院，上海200050;3.同濟大學附屬東方醫院，上海200040)

醫院感染爆發的定義是在短時間內發生3例以上同種同源感染病例的現象。對同種同源病例的定義，臨床大多以細菌耐藥菌譜作為同源性分析的依據，一直以來缺乏有效、實用、適用的實驗室監測手段。耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA)耐藥株感染率近年來快速上升，除了與抗菌藥物的濫用有關，還與菌株的克隆傳播有很大關系[1]。我們收集了上海同仁醫院臨床分離的38株MRSA，采用mecA基因相關高變區(mecA gene related hyper-variable region，HVR)多態性分析對其進行分型，了解其多態性分布狀況，為醫院感染爆發的確立提供實驗室依據。

材料和方法

一、材料

1.標本來源 38株MRSA菌株均來源于2013年7月至2013年9月上海同仁醫院的住院患者，非重復菌株。其中來自痰標本20株、咽拭子9株、尿液4、膽汁3株、膿液和導管各1株。

2.實驗儀器及試劑 VITEK 2-COMPACT全自動微生物分析系統及其配套的GP67藥敏板為法國梅里埃公司產品;血平板和MH平板購自上海伊華生物公司;細菌基因組DNA提取試劑盒購自上海之江生物公司;聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction，PCR)試劑 Takara TaqTMHot Start Version購自寶生物工程(大連)有限公司;DNA Marker(100 bp ladder)購自北京TIANGEN生物技術有限公司;金黃色葡萄球菌 HVR-PCR引物由北京奧科生物技術有限責任公司合成。Veriti 96-Well PCR擴增儀為ABI公司的產品;凝膠成像儀為TANON公司產品。

二、方法

1.細菌鑒定及藥敏 所有菌株均經VITEK 2-COMPACT全自動微生物分析系統進行菌種鑒定及體外藥敏分析。質控菌株為金黃色葡萄球菌ATCC25923和金黃色葡萄球菌ATCC29213。

2.細菌DNA的提取 嚴格按上海之江生物公司生產的細菌基因提取試劑盒說明書操作。

3.PCR引物 HVR引物序列根據文獻[2]。引物序列:P1為5’-ACTATTCCCTCAGGCGTCC-3’，P2 為 5’-GGAGTTAATCTACGTCTCATC-3’。

4.MRSA的HVR-PCR分型 取MRSA的菌株基因組DNA 1μL作為擴增的模板，加入PCR反應體系:HVR-PCR引物0.2μL(引物濃度為10 mmol/L)，10×PCR buffer 1μL，2.5 mmol/L dNTP 0.8μL，Taq 聚合酶0.05μL，滅菌去離子水6.95μL，反應總體積為 10μL。PCR 反應條件:94℃預變性1 min;94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃30 s，35個循環;72℃延伸4 min。擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳后在凝膠成像系統中進行分析。

結 果

一、MRSA的HVR-PCR分型結果及HVR基因型的分布

MRSA的HVR-PCR產物經電泳后可觀察到4種不同條帶，見圖1。根據這些條帶的不同(PCR產物片段大小)，38株MRSA被分為A、B、C、D 種基因型，其中以 C型23株(60.53%)，A型7株(18.42%)、B 型3 株(7.89%)、D 型2 株(5.26%)、未分型 3 株(7.89%)。C 型在各臨床科室均有分布，主要集中于老干部科。A、B、D和未分型則隨機分布在各臨床科室。見表1。

表1 MRSA的HVR基因型在各科的分布

圖1 MRSA的HVR-PCR擴增產物瓊脂糖凝膠電泳

二、MRSA的藥敏結果

MRSA對苯唑西林、青霉素的耐藥率為100%，對紅霉素、環丙沙星、克林霉素、莫西沙星、四環素、左氧氟沙星的耐藥率均在80%以上。對奎奴普汀/達福普汀、替加環素、萬古霉素的敏感率為100%，對利福平的敏感率為89.5%，利奈唑烷的敏感率為81.6%。見表2。

表2 MRSA對常用抗菌藥物的耐藥情況

討 論

由于MRSA抵抗力和毒力均較強，常存在多重耐藥，伴隨近年來分離率的增加，更被重視。在控制醫院感染方面，MRSA已經成為主要的引起暴發流行的致病菌，因而尋找傳染源、切斷傳播途徑顯得尤為重要[3]。

MRSA是指表達mecA基因或具有其它耐藥機制如青霉素結合蛋白與苯唑西林的親和力改變的金黃色葡萄球菌[4]。mecA基因是耐甲氧西林葡萄球菌特有的[5]，而HVR與該基因緊密相連，存在于其下游，也具有特異性。mec基因高變區的dru序列是位于mecA與IS431 mec之間、長約2 040 bp的片段，由一個40 bp的片段重復1～9次構成。在不同的MRSA菌株中dru重復次數不同，決定了MRSA基因的多態性，成為基因分型的分子基礎。本研究根據HVR長度多態性將38株MRSA分為4型，其中以C型多見(60.53%)，A 型7 株(18.42%)、B 型 3株(7.89%)、D 型 2株(5.26%)、未分型 3 株。王敏等[6]報道，用HVR-PCR方法將 MRSA按大小分為200、410、470、510及 600 bp共 5型，其中以 510 bp(61.25%)及 600 bp(21.25%)多見。曹鴻霞等[7]將安徽地區部分醫院分離的73株MRSA電泳后發現470～600 bp的3種基因型，以600 bp(58.8%)多見。說明MRSA的流行存在地區差異。本研究未發現200 bp的菌株，也可能是實驗菌株較少的原因。同時本研究結果顯示MRSA呈嚴重且多重耐藥，對苯唑西林、青霉素的耐藥率100%，對紅霉素、環丙沙星、克林霉素、莫西沙星、四環素、左氧氟沙星的耐藥率都在80%以上。故首選抗生素治療藥物為萬古霉素、替加環素、奎奴普汀/達福普汀和替考拉寧。

MRSA主要通過接觸傳播，很容易在醫院環境內流行，常可造成局部地區的爆發流行。因此本研究選擇了3個月內分離的所有的MRSA菌株，結果發現A型分離出7株，在醫院內呈散在分布;C型分離出23株，為本院MRSA流行株的優勢型別，各科室流行株之間具有高度同源性，提示科室之間存在交叉感染現象，應引起高度重視。C型集中于干部病房，表明MRSA菌株在干部病房內存在克隆傳播。這與干部病房特殊的住院時間、用藥特點及環境的交叉感染有關[9]。

利用PCR技術對MRSA進行分型的常用方法有隨機引物PCR、擴增片段長度多態性、特異功能集團基因的多態性等分型方法[10]。mecA基因HVR長度多態性分型屬于特異功能集團基因的多態性分型方法，只適合于MRSA菌株。本研究發現mecA基因HVR長度多態性分型在分型率、分辨力及結果上都較為可靠，可以為控制金黃色葡萄球菌感染提供詳實的流行病學資料，值得推廣。在MRSA流行病學研究中，往往會把幾種方法聯合使用，對MRSA的流行病學分析往往會更加準確。

綜上所述，醫院應采取嚴格的院內感染控制措施，防止MRSA耐藥株在醫院不同病區內的轉移。同時應積極開展簡便、快速的MRSA分型檢測，尋找感染來源，對阻斷MRSA在醫院內的爆發流行有重要的臨床意義。

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