K562細(xì)胞ssDNA適配子檢測(cè)方法對(duì)慢性粒細(xì)胞白血病診斷價(jià)值的研究

查成喜，邢福軍，張雪燕，郭 鵬，習(xí) 靜，韓躍武

(1.甘肅省中醫(yī)院檢驗(yàn)科，甘肅蘭州730050;2.蘭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)研究所，甘肅蘭州730000)

白血病(leukemia)是起源于骨髓多能造血干細(xì)胞的惡性增殖性腫瘤，是十大高發(fā)性腫瘤之一。其中慢性粒細(xì)胞性白血病(chronic myeloid leukemia，CML)約占各類白血病的20%，占慢性白血病的95%。臨床上CML的診斷主要依靠血象、骨髓象、細(xì)胞化學(xué)染色以及用流式細(xì)胞儀檢測(cè)白血病細(xì)胞抗原[1-2]。但是血象檢查無(wú)特異性;骨髓穿刺具有一定的風(fēng)險(xiǎn)性，且技術(shù)要求較高;細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果受影響的因素較多，如試劑、每個(gè)實(shí)驗(yàn)人員判斷標(biāo)準(zhǔn)等，使結(jié)果相差很大;流式細(xì)胞儀檢測(cè)價(jià)格昂貴，不能作為常規(guī)體檢的項(xiàng)目對(duì)白血病進(jìn)行人群普查[3-4]。我們利用前期建立的高靈敏度、高特異性的K562細(xì)胞ssDNA核酸適配子檢測(cè)方法(簡(jiǎn)稱適配子檢測(cè)法)[5-6]檢測(cè)臨床白血病患者血液標(biāo)本，評(píng)價(jià)該法在臨床CML診斷中的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

材料和方法

一、標(biāo)本收集及處理

選擇2010年6月至2011年10月首次入院，經(jīng)臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)[2]確診的CML患者18例(男10例，女8例，平均年齡35歲)、其他白血病患者22例(男10例，女12例，平均年齡37歲)，另選取同期健康體檢者20名作為正常對(duì)照組，男10例，女10例，平均年齡35歲。

二、儀器及試劑

RF-5301PC型熒光分光光度計(jì)(日本);Promega鏈霉親和素磁珠及磁力架(Promega公司);洗滌緩沖液:4.5 g/L葡萄糖、5 mmol/L MgCl2·6H2O 溶于含0.1 g/L MgCl2和0.133 g/L CaCl2的磷酸鹽緩沖液(PBS);結(jié)合緩沖液:洗滌緩沖液中加入0.1 mg/mL tRNA、1 mg/mL BSA和0.1%疊氮鈉。其它試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水均為去離子水。

三、方法

分別采集所有對(duì)象靜脈血5 mL，分離粒細(xì)胞，－20℃保存?zhèn)溆谩０凑諛?gòu)建的檢測(cè)體系的相關(guān)參數(shù)[6]，分別與上述36例血樣1×106個(gè)中性粒細(xì)胞37℃黑暗環(huán)境孵育，用結(jié)合緩沖液洗滌，上磁力架，收集沉淀，加入400μL結(jié)合緩沖液，即適配子-細(xì)胞-適配子復(fù)合物。用熒光分光光度計(jì)測(cè)定復(fù)合物熒光強(qiáng)度，測(cè)定3次，取平均值。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

結(jié) 果

一、各組適配子-細(xì)胞-適配子復(fù)合物的熒光強(qiáng)度比較

所有數(shù)據(jù)分布基本符合正態(tài)分布，95%分布區(qū)間為(463.23，488.71)。CML 組適配子-細(xì)胞-適配子復(fù)合物熒光強(qiáng)度為492.26±41.67，與其它白血病組(466.86±33.23)及正常對(duì)照組(469.33 ±37.13)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P 值分別為0.078、0.243);其它白血病組與正常對(duì)照組之間差異亦無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.835)。

二、適配子檢測(cè)法對(duì)CML診斷價(jià)值的評(píng)價(jià)

適配子檢測(cè)法診斷CML的ROC曲線下面積為 0.702，最佳臨界值為 475.13，見(jiàn)圖 1。以適配子-細(xì)胞-適配子復(fù)合物熒光強(qiáng)度≥475.13為陽(yáng)性，對(duì)CML的診斷結(jié)果見(jiàn)表1。靈敏度(Sen)為83.33%、特異性(Spe)為 54.76%、陽(yáng)線預(yù)測(cè)值(pv+)為44.11%、陰性預(yù)測(cè)值(pv－)為88.46%、診斷效率(DE)為 30%、診斷指數(shù)(DI)為138.09%、可用度(DA)為 0.38、可靠度(DR)為0.86、優(yōu)勢(shì)比(RP)為6.05。

圖1 適配子檢測(cè)法診斷CML的ROC曲線

表1 臨床診斷和適配子檢測(cè)法的診斷結(jié)果比較

討 論

本研究結(jié)果顯示適配子檢測(cè)法診斷CML的ROC曲線下面積為 0.702;當(dāng)最佳臨界值為475.13時(shí)，適配子檢測(cè)法診斷CML的靈敏度為83.33%、特異性為54.76%;通過(guò)ROC曲線結(jié)果及與評(píng)價(jià)指標(biāo)參考區(qū)間[10]的比較，適配子檢測(cè)法對(duì)CML臨床診斷具有較低的準(zhǔn)確性，實(shí)際應(yīng)用還有一定的局限性，目前還不具備真正的臨床應(yīng)用價(jià)值。我們推測(cè)造成該法無(wú)臨床應(yīng)用價(jià)值的原因主要有:(1)收集CML標(biāo)本數(shù)量較少，未能進(jìn)行大量樣本的檢測(cè)，相對(duì)容易產(chǎn)生偏倚;(2)所應(yīng)用的核酸適配子是在前期試驗(yàn)中以CML K562細(xì)胞株為材料，經(jīng)cell-SELEX篩選得到的，雖然甄別K562細(xì)胞具有較高的特異性和親和力，但是臨床CML患者血細(xì)胞在形態(tài)結(jié)構(gòu)、細(xì)胞膜表面物質(zhì)表達(dá)等方面可能具有一定的差異性;(3)收集的血標(biāo)本放置時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，沒(méi)有及時(shí)處理等原因，造成細(xì)胞死亡或形態(tài)結(jié)構(gòu)改變，引起結(jié)合熒光強(qiáng)度降低，本研究中適配子檢測(cè)法診斷CML的特異性僅為54.76%。

綜上所述，適配子檢測(cè)法目前尚不能應(yīng)用于臨床診斷CML。我們期望通過(guò)后續(xù)增加樣本量、進(jìn)一步加強(qiáng)與臨床合作、重新針對(duì)臨床細(xì)胞篩選核酸適配子等手段將其真正應(yīng)用于臨床診斷中，為臨床醫(yī)師診斷腫瘤提供一種更靈敏、更簡(jiǎn)便、更經(jīng)濟(jì)的檢測(cè)方法，為社會(huì)和廣大患者做出積極的貢獻(xiàn)。同時(shí)，進(jìn)行有關(guān)腫瘤體內(nèi)外分子成像的研究，為腫瘤診斷提供一種新的分子探針技術(shù)。

[1]王谷云，姚紅霞.慢性粒細(xì)胞白血病的治療進(jìn)展[J].醫(yī)學(xué)綜述，2009，15(13):1998-2000.

[2]沈 君，王開(kāi)泰，陸紅娟.慢性粒細(xì)胞白血病的診斷與治療[J].中國(guó)實(shí)用內(nèi)科雜志，2008，28(S1):203-205.

[3]Von Bubnoff N，Duyster J.Chronic myelogenous leukemia:treatment and monitoring[J].Dtsch Arztebl Int，2010，107(7):114-121.

[4]Wadleigh M，Tefferi A.Classification and diagnosis of myeloproliferative neoplasms according to the 2008 World Health Organization criteria[J].Int J Hematol，2010，91(2):174-179.

[5]劉玲玲，韓躍武，祝凱平，等.慢性髓細(xì)胞性白血病K562細(xì)胞適體的篩選與鑒定[J].醫(yī)學(xué)爭(zhēng)鳴，2009，30(13):1157-1160.

[6]Meng L，Sefah K，Colon DL，et al.Using live cells to generate aptamers for cancer study[J].MethodsMol Biol，2010，629:355-367.

[7]查成喜，韓躍武，張雪燕，等.基于ssDNA適配子的慢性粒細(xì)胞白血病K562細(xì)胞檢測(cè)方法的建立[J].中國(guó)生物制品學(xué)雜志，2011，24(7):845-848.

[8]Armitage P，Colton T.Encyclopedia of biostatistics[M].New York:John，1998:3738-3744.

[9]Moses LE，Shapiro D，Littenberg B.Combining independent studiesofa diagnostic testinto a summary ROC curve:data-analytic approaches and some additional considerations[J].Stat Med，1993，12(14):1293-1316.

[10]楊有業(yè)，張秀明.臨床檢驗(yàn)方法學(xué)評(píng)價(jià)[M].北京:人民衛(wèi)生出版社，2008:81-100.