脈沖電磁場(chǎng)聯(lián)合電針療法對(duì)去卵巢大鼠骨質(zhì)疏松的影響

周 君，何紅晨,肖 登,陳世菊,劉慧芳,覃渝茜,何成奇

(1.南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院康復(fù)科，湖南 衡陽(yáng)421001；2.四川大學(xué)華西醫(yī)院康復(fù)科 康復(fù)醫(yī)學(xué)四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室)

骨質(zhì)疏松癥是一種伴隨增齡衰老或醫(yī)學(xué)原因引起的以骨量降低、骨微細(xì)結(jié)構(gòu)受損導(dǎo)致骨脆性增加和易于發(fā)生骨折的一種全身性骨骼疾病[1]。隨著中國(guó)人口老齡化，骨質(zhì)疏松癥及其骨質(zhì)疏松性骨折這一問(wèn)題也更加突出，嚴(yán)重影響中老年人的生活質(zhì)量，并且醫(yī)療支出巨大，給個(gè)人、家庭、社會(huì)帶來(lái)沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。臨床研究表明脈沖電磁場(chǎng)(pulsed electromagnetic fields，PEMFs)[2-3]和針灸[4]均能增加骨密度、緩解患者疼痛癥狀及提高患者生活質(zhì)量，顯示出很廣的臨床應(yīng)用前景。本課題組前期實(shí)驗(yàn)研究顯示脈沖電磁場(chǎng)[5-6]和電針療法[7]均能改善骨代謝生化指標(biāo)、增加骨密度及改善骨生物力學(xué)性能。骨質(zhì)疏松癥作為一種多因性、復(fù)雜的慢性疾病，應(yīng)進(jìn)行綜合康復(fù)治療。進(jìn)行多種治療方法聯(lián)合應(yīng)用以求發(fā)揮最大協(xié)同療效的研究是有意義的，必將更好地為患者服務(wù)。本研究觀察脈沖電磁場(chǎng)聯(lián)合電針療法對(duì)去卵巢大鼠骨密度、骨組織形態(tài)和骨生物力學(xué)性能指標(biāo)的影響，探索聯(lián)合治療是否具有協(xié)同作用，為脈沖電磁場(chǎng)聯(lián)合電針療法應(yīng)用于骨質(zhì)疏松癥的治療作理論和實(shí)踐的探索。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

XT-2000B型骨質(zhì)疏松治療治療儀(中國(guó)，天津)；華佗牌SDZ-V型電針治療儀(中國(guó)，江蘇)；雙能X線骨密度測(cè)量?jī)x(DEXA，美國(guó))；Laica切片機(jī)(德國(guó))；奧林巴斯光學(xué)顯微鏡(日本)；AGS-J電子萬(wàn)能試驗(yàn)機(jī)(日本)。3月齡未育雌性Sprague-Dawley大鼠50只，由四川大學(xué)華西醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 方法

1.2.1 分組與造模 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)于四川大學(xué)華西醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，清潔級(jí)環(huán)境。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，按隨機(jī)數(shù)字表法把50只實(shí)驗(yàn)大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、去勢(shì)組、脈沖電磁場(chǎng)組、電針組和聯(lián)合組，每組10只。參照文獻(xiàn)[8]，除假手術(shù)組外，其余各組大鼠均施行雙側(cè)卵巢切除術(shù)，術(shù)后每只大鼠肌肉注射青霉素4萬(wàn)U，每天1次，連用3天以預(yù)防感染。假手術(shù)組大鼠只切除卵巢周圍與卵巢大小相仿的脂肪組織。每只實(shí)驗(yàn)大鼠分籠飼養(yǎng)在溫度20～26℃、濕度60％～70％、12 h間隔照明的環(huán)境中，自由攝食和水。

1.2.2 干預(yù)方法 去卵巢術(shù)后1周，各治療組給予相應(yīng)干預(yù)治療。脈沖電磁場(chǎng)組：采用XT-2000B型骨質(zhì)疏松治療治療儀,具體干預(yù)參數(shù)為：強(qiáng)度3.82 mT，頻率8 Hz，時(shí)間每次40 min，每天1次，每周5天，共12周。電針組：穴位雙側(cè)“足三里”、 “三陰交”，采用直徑0.25 mm、長(zhǎng)度25 mm一次性無(wú)菌針灸針刺入，進(jìn)針后針柄連接電針，波形為疏密波，疏波頻率3 Hz，密波頻率15 Hz，波寬1 ms，強(qiáng)度以局部肌肉輕微收縮為度 (0.7～1.0 mA)，每次30 min，每天1次，每周5天，共12周。聯(lián)合組：采用脈沖電磁場(chǎng)聯(lián)合電針療法，具體操作同以上兩組。假手術(shù)組和去勢(shì)組不予任何干預(yù)。

1.2.3 標(biāo)本采集及組織形態(tài)學(xué)觀察 干預(yù)12周后，處死大鼠后，迅速取出左側(cè)股骨，剝離肌肉,用于骨密度和生物力學(xué)性能檢測(cè)；取出左側(cè)脛骨，生理鹽水沖洗,40 g/L中性緩沖甲醛固定,100 g/L乙二胺四乙酸二鈉脫鈣,每2天更換脫鈣液1次,共脫鈣4周,系列乙醇脫水,二甲苯透明,石蠟包埋,切片厚度5 μm，常規(guī)HE染色，光鏡下觀察骨組織形態(tài)結(jié)構(gòu)。

1.2.4 骨密度測(cè)定 用雙能X線骨密度測(cè)量?jī)x測(cè)定實(shí)驗(yàn)動(dòng)物左股骨骨密度,將股骨放在盛有深約2.5 cm的蒸餾水(用于模擬骨周圍的軟組織)的容器中，用小動(dòng)物軟件進(jìn)行掃描。測(cè)量完畢后，股骨標(biāo)本用生理鹽水濕紗布包裹后保存于-20℃環(huán)境中，以備生物力學(xué)測(cè)定。

1.2.5 骨生物力學(xué)性能測(cè)定 測(cè)量時(shí)取出標(biāo)本復(fù)溫后，在電子萬(wàn)能材料試驗(yàn)機(jī)上做股骨三點(diǎn)彎曲試驗(yàn)和L5椎體壓縮試驗(yàn)，直到骨折。三點(diǎn)彎曲試驗(yàn)時(shí)支點(diǎn)跨距為20 mm，兩個(gè)試驗(yàn)的加載速度均為2 mm/min，用函數(shù)記錄儀描記載荷-位移曲線，記錄最大載荷和破壞能2個(gè)指標(biāo)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 骨密度檢測(cè)

左股骨骨密度與假手術(shù)組比較，去勢(shì)組骨密度明顯下降(P<0.01)；脈沖電磁場(chǎng)組、電針組和聯(lián)合組的骨密度比去勢(shì)組顯著增高(P<0.01，P<0.05)；而脈沖電磁場(chǎng)組、電針組和聯(lián)合組3組之間股骨骨密度無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。L5椎體骨密度與假手術(shù)組比較，去勢(shì)組骨密度明顯下降(P<0.01)；脈沖電磁場(chǎng)組、電針組和聯(lián)合組的骨密度比去勢(shì)組顯著增高(P<0.01)；與脈沖電磁場(chǎng)組和電針組比較，聯(lián)合組L5椎體骨密度明顯增高(P<0.05)(圖1)。

圖1 股骨及L5椎體骨密度檢測(cè)

2.2 骨組織形態(tài)學(xué)觀察

如圖2所示，與假手術(shù)組比較，去勢(shì)組骨小梁面積、骨小梁數(shù)量和骨小梁鏈接數(shù)明顯減少，骨髓腔顯著增大；然而，經(jīng)過(guò)12周干預(yù)治療后，脈沖電磁場(chǎng)組、電針組和聯(lián)合組與去勢(shì)組比較，骨小梁面積、骨小梁數(shù)量和骨小梁鏈接數(shù)明顯增加，而骨髓腔顯著減少。

圖2 干預(yù)12周后各組脛骨HE染色結(jié)果(×100)

2.3 骨生物力學(xué)檢測(cè)

股骨三點(diǎn)彎曲試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)(圖3)，與假手術(shù)組比較，去勢(shì)組最大載荷明顯下降(P<0.01)；脈沖電磁場(chǎng)組和聯(lián)合組的最大載荷比去勢(shì)組顯著增高(P<0.05)；而脈沖電磁場(chǎng)組、電針組和聯(lián)合組3組之間最大載荷無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。與假手術(shù)組比較，去勢(shì)組破壞能明顯下降(P<0.05)；脈沖電磁場(chǎng)組、電針組和聯(lián)合組的破壞能與去勢(shì)組比較，差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

L5椎體壓縮試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)(圖4)，與假手術(shù)組比較，去勢(shì)組最大載荷明顯下降(P<0.01)；脈沖電磁場(chǎng)組、電針和聯(lián)合組的最大載荷比去勢(shì)組顯著增高(P<0.01)；與脈沖電磁場(chǎng)組和電針組比較，聯(lián)合組最大載荷明顯增高(P<0.05，P<0.01)。與假手術(shù)組比較，去勢(shì)組破壞能明顯下降(P<0.01)；與去勢(shì)組比較，脈沖電磁場(chǎng)組、電針組和聯(lián)合組的破壞能顯著增高(P<0.01)；與脈沖電磁場(chǎng)組和電針組比較，聯(lián)合組破壞能明顯增高(P<0.01)。

3 討 論

圖3 股骨三點(diǎn)彎曲試驗(yàn)

圖4 L5椎體壓縮試驗(yàn)

隨著全球人口老齡化，骨質(zhì)疏松癥及骨質(zhì)疏松性骨折的發(fā)病率逐漸上升。目前，尚無(wú)確切的全國(guó)性骨質(zhì)疏松癥患病率資料，國(guó)內(nèi)部分地區(qū)(北京、石家莊、上海、長(zhǎng)春、廣州和成都)原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥總患病率(按骨密度累計(jì)丟失率最高部位計(jì)算)為12.4％[9],50歲以上人群總骨折患病率為26.6％,髖部骨折患病率為1.9％，脊椎骨折患病率為13.3％[10]。2005年美國(guó)超過(guò)200萬(wàn)人發(fā)生骨質(zhì)疏松性骨折，直接經(jīng)濟(jì)花費(fèi)為170億美元[11]。骨質(zhì)疏松癥及其骨質(zhì)疏松性骨折嚴(yán)重影響中老年人的生活質(zhì)量，并且相關(guān)醫(yī)療花費(fèi)巨大，給個(gè)人、家庭及社會(huì)帶來(lái)沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。因此，探索骨質(zhì)疏松癥的有效而安全的治療方法，具有肯定的社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益。

骨質(zhì)疏松癥作為一種常見(jiàn)多發(fā)的慢性疾病，臨床上常進(jìn)行綜合康復(fù)治療，探討多種治療方法聯(lián)合應(yīng)用以求發(fā)揮最大協(xié)同療效并研究其作用機(jī)制具有重要意義。目前國(guó)內(nèi)外僅見(jiàn)1項(xiàng)有關(guān)脈沖電磁場(chǎng)聯(lián)合電針治療骨質(zhì)疏松癥的臨床研究報(bào)告[12]，而未見(jiàn)有關(guān)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)研究。因此，本研究擬通過(guò)觀察脈沖電磁場(chǎng)、電針及脈沖電磁場(chǎng)聯(lián)合電針療法對(duì)去卵巢大鼠骨密度、骨組織形態(tài)、骨生物力學(xué)性能的影響，探索脈沖電磁場(chǎng)與電針是否具有協(xié)同作用。作為治療骨質(zhì)疏松癥的新技術(shù)，脈沖電磁場(chǎng)的有效性正受到業(yè)界高度關(guān)注，脈沖電磁場(chǎng)對(duì)骨質(zhì)疏松引起的疼痛、骨量丟失、骨密度降低具有肯定的治療作用[2-3]。前期實(shí)驗(yàn)研究[5-6]也顯示脈沖電磁場(chǎng)能提高去勢(shì)大鼠血清雌二醇水平、增加去勢(shì)大鼠骨密度，改善骨生物力學(xué)性能。臨床研究顯示針灸也能增加骨質(zhì)疏松癥患者骨密度、緩解患者疼痛癥狀及提高患者生活質(zhì)量[4]。盡管中醫(yī)學(xué)中無(wú)骨質(zhì)疏松癥這一病名，但根據(jù)其臨床表現(xiàn)，可歸屬于中醫(yī)學(xué)“骨痿”范疇，其病理基礎(chǔ)是腎虛和脾虛，病變的臨床表現(xiàn)多為瘀血阻絡(luò)之像，針灸治療以補(bǔ)益脾腎、強(qiáng)筋健骨為治療原則。前期研究表明針刺足三里、三陰交能改善去勢(shì)大鼠骨代謝生化指標(biāo)、提高骨密度、改善骨生物力學(xué)性能，激活成骨細(xì)胞Wnt/β-catenin信號(hào)通路，促進(jìn)骨形成[7]。足三里為足陽(yáng)明胃經(jīng)的合穴，三陰交為足三陰經(jīng)的交會(huì)穴，針刺這兩個(gè)穴位能補(bǔ)腎健脾，益髓補(bǔ)骨，強(qiáng)筋健骨。所以，在本研究中選用電針足三里及三陰交這兩個(gè)穴位。

骨密度是衡量骨量多少的定量指標(biāo)，可以測(cè)量出不同部位如髖部或脊柱的骨礦物質(zhì)的含量，骨密度已經(jīng)成為診斷骨質(zhì)疏松癥的金標(biāo)準(zhǔn)[1]。基于去勢(shì)大鼠皮質(zhì)骨和小梁骨骨量丟失程度和速度的差異性[13]，本研究分別檢測(cè)小梁骨豐富的L5椎體和皮質(zhì)骨為主的股骨的骨密度。本研究中去勢(shì)導(dǎo)致大鼠股骨骨密度下降，而脈沖電磁場(chǎng)、電針及聯(lián)合療法均能增加其骨密度，但是聯(lián)合療法并不比脈沖電磁場(chǎng)、電針單獨(dú)使用療效更好。對(duì)于小梁骨豐富的L5椎體，在去勢(shì)手術(shù)后，骨密度顯著降低，而脈沖電磁場(chǎng)、電針和聯(lián)合療法均能增加其骨密度，而且，聯(lián)合療法增加骨密度的療效還優(yōu)于脈沖電磁場(chǎng)或電針單獨(dú)使用的療效。本研究結(jié)果顯示脈沖電磁場(chǎng)、電針及聯(lián)合療法均能增加去勢(shì)大鼠L5椎體及股骨骨密度，而且，對(duì)于腰椎骨密度的提高，脈沖電磁場(chǎng)聯(lián)合電針療法具有協(xié)同作用，而對(duì)股骨骨密度的提高，聯(lián)合治療并不優(yōu)于脈沖電磁場(chǎng)或電針單獨(dú)使用。聯(lián)合療法對(duì)L5椎體和股骨骨密度提高程度不同，這可能與股骨主要由皮質(zhì)骨組成，L5椎體由小梁骨組成的結(jié)構(gòu)差異性造成的。

骨的生物力學(xué)性能由骨量和骨的質(zhì)量?jī)煞矫鏇Q定[14]。骨量可以用定量指標(biāo)骨密度去衡量，而骨質(zhì)量包括一系列的骨組織特性：骨的形態(tài)、微細(xì)結(jié)構(gòu)、微損傷程度等。所以，本研究觀察了脈沖電磁場(chǎng)、電針及聯(lián)合治療對(duì)去勢(shì)大鼠骨組織形態(tài)學(xué)的影響，結(jié)果顯示經(jīng)過(guò)12周干預(yù)治療后，脈沖電磁場(chǎng)、電針和聯(lián)合療法均能增加骨小梁面積、骨小梁數(shù)量和骨小梁鏈接數(shù)明顯增加，減少骨髓腔的大小。

骨生物力學(xué)性能是反映骨易碎性的指標(biāo)，可以預(yù)測(cè)骨折發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)，改善骨的生物力學(xué)性能，是目前判斷一種治療方法治療骨質(zhì)疏松癥是否有效的一個(gè)關(guān)鍵指標(biāo)[15]。在骨質(zhì)疏松癥患者，最關(guān)心的就是骨的生物強(qiáng)度，對(duì)于正常骨不引起骨折的負(fù)荷而在骨質(zhì)疏松癥中而可以導(dǎo)致骨折。所以很多研究探索了骨量丟失在骨的生物力學(xué)性能下降中的重要程度，對(duì)絕經(jīng)后婦女或動(dòng)物模型的骨組織進(jìn)行了各種各樣的生物力學(xué)檢測(cè)，包括壓縮、彎曲、剪切等。骨質(zhì)疏松癥患者椎體的最大應(yīng)力和最大彈性模量下降[16]，去勢(shì)動(dòng)物模型的椎體壓縮和股骨三點(diǎn)彎曲試驗(yàn)都提示骨生物力學(xué)性能下降[17]。本研究觀察了脈沖電磁場(chǎng)、電針及聯(lián)合療法對(duì)股骨三點(diǎn)彎曲試驗(yàn)和椎體壓縮試驗(yàn)的影響，結(jié)果顯示去勢(shì)大鼠股骨和L5椎體的最大載荷和破壞能顯著下降。脈沖電磁場(chǎng)、聯(lián)合療法可以增加股骨的最大載荷，而脈沖電磁場(chǎng)、電針及聯(lián)合療法對(duì)股骨破壞能沒(méi)有明顯影響。脈沖電磁場(chǎng)、電針及聯(lián)合療法均能增加腰椎的最大載荷和破壞能，并且聯(lián)合療法優(yōu)于脈沖電磁場(chǎng)或電針單獨(dú)治療。

本研究結(jié)果顯示脈沖電磁場(chǎng)聯(lián)合電針療法對(duì)去勢(shì)大鼠股骨骨密度及生物力學(xué)性能改善并不優(yōu)于脈沖電磁場(chǎng)或電針療法單獨(dú)使用，而聯(lián)合療法對(duì)椎體骨密度及生物力學(xué)性能改善明顯優(yōu)于脈沖電磁場(chǎng)或電針療法單獨(dú)使用，提示盡管這兩種治療方法協(xié)同作用機(jī)制尚不明確，在臨床聯(lián)合應(yīng)用脈沖電磁場(chǎng)和電針療法對(duì)骨質(zhì)疏松癥患者腰椎骨密度和生物力學(xué)性能的改善可能比這兩種治療方法單獨(dú)使用更為有效。對(duì)于協(xié)同作用的機(jī)制及兩種治療方法的安全性尚需進(jìn)一步的研究。

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