烷氧染料木黃酮衍生物的合成及其抗癌活性研究

姚 旭，鄭自通，郭 玉，余柳英，魏 云，鄭 興

(1.南華大學藥學系，湖南 衡陽 421001；2.南華大學附屬第二醫院藥劑科)

染料木黃酮(genistein，GEN)，主要存在于豆科植物中，是一種具有多種生物活性的大豆異黃酮，具有弱雌激素活性[1-2]、抗氧化活性和抗真菌活性[3-4]，對肝癌[5]、結腸癌[6]、肺癌[7]、胃癌[8]和前列腺癌[9]等多種疾病有積極的預防和治療作用。但因染料木黃酮在腸道內吸收甚少或者完全不吸收致使其活性較低而限制了它的臨床應用[10]。為了提高染料木黃酮的生物利用度，達到增強其抗癌活性的目的，本文以體外培養的人急性粒細胞性白血病(HL-60)細胞、人結腸癌細胞(HT-29)和人胃癌(SGC-7901)細胞為研究對象，以5-氟尿嘧啶(5-Fluorouracil,5-Fu)為陽性對照，選用MTT法對合成的4個烷氧染料木黃酮衍生物進行體外抗癌活性篩選。

1 材料與方法

1.1 主要材料

所用試劑均為分析純，柱層析用硅膠G購自青島海洋化工廠，HL-60細胞、SGC-7901細胞、HT-29細胞均由中南大學腫瘤研究所提供。X-5顯微熔點測定儀，溫度未校正；Bruker AM-300(300 MHz)型核磁共振儀，TMS作內標；Shimadzu IR-440型紅外分光光度儀，溴化鉀壓片；HP-5989A型質譜儀；Italian Carlo-Erba 1106型元素分析儀；Bruker Apex Ⅱ質譜儀。

1.2 烷氧染料木黃酮衍生物的制備

染料木黃酮(100 mg，0.3 mmol)，用適量丙酮溶解，加入鹵代烴RX(3 mmol)，K2CO3作催化劑，回流24 h，過濾，柱層析得到化合物2a、2b和3a、3b(見圖1)。

圖1 化合物2a、2b、3a、3b合成路線圖

1.3 MTT法檢測所合成染料木黃酮衍生物的抗癌活性

HL-60、HT-29、SGC-7901細胞培養于含10％熱滅活小牛血清RPMI-1640培養基的培養瓶中，5％二氧化碳的培養箱內培養傳代，實驗取對數生長期細胞。實驗在96孔細胞培養板中進行，以含細胞的加料RPMI-1640培養基接種于實驗組、陽性對照組(5-Fu濃度為0.25 μmol/L)，溶媒對照組及調零組，每組設6個平行樣本，每孔100 μL單細胞懸液(約2×104個細胞)。實驗組每孔加入以培養基稀釋的藥物100 μL，溶媒對照組加入等量的含0.02％DMSO和0.01％ Tween-80的培養液，調零組加入無血清RPMI-1640培養基100 μL，置二氧化碳培養箱培養48 h。每孔加入20 μL MTT液(5 g/L)，混勻，繼續培養4～6 h，1 000 r/min離心10 min后吸除上清液，每孔加入100 μL DMSO溶液，震蕩10 min，使紫藍色沉淀充分溶解，在(EX-800型)酶標儀下，用調零孔校正零點，以570 nm波長測定A值。以6孔A值均數計算相對抑制率(IR)：IR=(1-實驗組A值/對照組A值)×100％，重復3批實驗。半數抑制濃度(50％ concentration of inhibition，IC50)采用SPSS軟件計算。

2 結 果

2.1 化合物的合成

本實驗合成了4個染料木黃酮衍生物2a、2b、3a、3b。

化合物2a Yield 83.5％；m.p.138～139 ℃；MS(EI，70 eV)m/z(％)：298(M+，100.00)，271(34.39)，132(21.39)，299(19.86)，166(19.24)，283(12.00)，138(11.48)，89(10.61)；1H NMR(300 MHz，CDCl3)：3.381(3H，s，OCH3)，3.900(3H，s，OCH3)，6.407(1H，d，J=2.4Hz，H-6)，6.422(1H，d，J=2.4Hz，H-8)，7.003(2H，d，J=9.9Hz，H-3′and H-5′)，7.484(2H，d，J=9.9Hz，H-2′and H-6′)，7.893(1H，s，H-2)，12.890(1H，s，OH)。以上數據與文獻[11]報道的基本一致，可以確定該化合物為5-羥基-4′,7-二甲氧基染料黃酮。

化合物2b Yield 77.5％；m.p.117～119.5 ℃；MS(EI，70 eV)m/z(％)：349(M+，100.00)，308(37.62)，350(M+，23.86)，275(17.25)，291(16.94)，41(14.77)，293(14.48)；IR υmax(cm-1，KBr)：1649(C=O)，2954(OH)；1H NMR(300 MHz，CDCl3)：4.556～5.087(4H，m，2×CH2O)，5.283～5.485(4H，m，2×CH2)，5.928～6.114(2H，m，2×CH)，6.372(2H，d，J=8.7Hz，H-3′and H-5′)，6.982(1H，d，J=2.1Hz，H-6)，7.428(1H，d，J=2.1Hz，H-8)，7.833(2H，d，J=8.7Hz，H-2′and H-6′)，7.862(1H，s，H-2)，12.981(1H，s，OH)；13C NMR(CDCl3)：180.824(C=O，C-4)，164.461(C-7)，162.722(C-5)，158.816(C-4′)，157.877(C-9)，152.675(C-2)，133.077(allyl-4′，CH)，132.047(allyl-7，CH)，130.056(2C，C-2′and C-6′)，123.633(C-3)，123.076(C-1′)，118.507(allyl-4′，CH2)，117.797(allyl-7，CH2)，114.906(2C，C-3′and C-5′)，114.654(C-10)，98.772(C-6)，93.134(C-8)，69.120(allyl-4′，OCH2)，68.868(allyl-7，OCH2)；Anal.Calcd.for C21H18O5：C，71.99，H，5.18；Found：C，71.86，H，5.16。

化合物3a Yield 10.1％；m.p.161～163 ℃；MS(EI，70 eV)m/z(％)：312(M+，100.00)，313(75.82)，266(29.62)，267(25.53)，132(22.94)，283(20.88)，281(19.92)，282(17.92)；1H NMR(300 MHz，DMSO-d6)：3.759(3H，s，OCH3)，3.806(3H，s，OCH3)，3.857(3H，s，OCH3)，6.484(1H，d，J=2.4Hz，H-6)，6.635(1H，d，J=2.4Hz，H-8)，6.940(2H，d，J=8.7Hz，H-3′and H-5′)，7.416(2H，d，J=8.7Hz，H-2′and H-6′)，8.167(1H，s，H-2)。以上數據與文獻[11]報道的基本一致，可以確定該化合物為4′,5,7-三甲氧基染料黃酮。

化合物3b Yield 11.6％；m.p.101～104 ℃；MS(EI，70 eV)m/z(％)：390(M+，100.00)，361(95.87)，293(88.82)，41(45.92)，321(44.10)，349(37.56)，252(37.22)，362(34.97)；IR υmax(cm-1，KBr)：1644(C=O)；1H NMR(300 MHz，CDCl3)：4.546～4.637(6H，m，3×CH2O)，5.262～5.688(6H，m，3×CH2)，6.002～6.110(3H，m，3×CH)，6.383(2H，d，J=2.1Hz，H-6)，6.425(1H，d，J=2.1Hz，H-8)，6.939(2H，d，J=8.7Hz，H-3′and H-5′)，7.440(2H，d，J=8.7Hz，H-2′and H-6′)，7.719(1H，s，H-2)；13C NMR(CDCl3)：175.179(C=O，C-4)，162.546(C-7)，160.303(C-5)，159.762(C-4′)，158.419(C-9)，149.970(C-2)，133.237(allyl-5，CH)，132.108(2C，allyl-7，allyl-4′，CH)，130.361(2C，C-2′and C-6′)，126.028(C-3)，124.548(C-1′)，118.545(allyl-5，CH2)，118.003(allyl-4′，CH2)，117.614(allyl-7，CH2)，114.555(2C，C-3′and C-5′)，110.268(C-10)，97.803(C-6)，93.592(C-8)，69.837(allyl-5，OCH2)，69.158(allyl-4′，OCH2)，68.799(allyl-7，OCH2)；Anal.Calcd.For C24H22O5：C，73.83，H，5.68；Found：C，73.87，H，5.72。

2.2 染料木黃酮衍生物體外抗癌活性

以5-Fu為陽性對照，MTT法檢測原料藥染料木黃酮1與合成的4個烷氧染料木黃酮衍生物2a、2b、3a、3b對HL-60、HT-29、SGC-7901細胞增殖抑制作用，結果見表1。其中化合物3a對HL-60、HT-29和 SGC-7901細胞增殖的抑制作用均強于5-Fu。

表1 黃酮類化合物對HT-29、SGC-7901和HL-60細胞增殖的影響

3 討 論

本文將部分烷氧基團引入到染料木黃酮的結構中，并通過MTT法檢測它們對HL-60、HT-29、SGC-7901細胞增殖抑制作用。初步藥理活性研究表明：所合成的染料木黃酮衍生物對HL-60、HT-29、SGC-7901細胞增殖均有不同程度的抑制作用，其中衍生物3b對HL-60的抑制作用最強，衍生物3a對HL-60、HT-29、SGC-7901抑制增殖作用均明顯強于陽性對照藥5-Fu，這為進一步獲得高效、低毒的抗癌先導物提供有利的依據。

[1]Boué SM,Wiese TE,Nehls S,et al.Evaluation of the estrogenic effects of legume extracts containing phytoestrogens[J].J Agric Food Chem,2003,51 (8):2193-2199.

[2]湯凌,任國峰.染料木黃酮在性激素相關疾病研究中的進展[J].中國老年學雜志,2009,29 (11):1436-1438.

[3]井樂剛,路芳,張永忠.大豆異黃酮的抗氧化活性[J].食品與發酵工業,2004,30 (2):62-65.

[4]Benjamin SB,Bond JH.Transmission of infection by endoscopy[J].Ann Intern Med,1993,119 (5):440-441.

[5]Mansoor TA,Ramalho RM,Luo X,et al.Isoflavones as apoptosis inducers in human hepatoma HuH-7 cells[J].Phytother Res,2011,25 (12):1819-1824.

[6]龔軍,王正文,朱明才,等.金雀異黃素和5-FU對人結腸癌細胞株(SW480)的相互作用的體外觀察[J].中國現代醫學雜志,2006,16 (6):873-876.

[7]田甜甜,李際盛,王亞偉,等.染料木黃酮在小細胞肺癌H446細胞中通過抑制FoxM1通路發揮抗腫瘤作用[J].山東大學學報：醫學版,2013,51 (6):44-48.

[8]張俊文,王丕龍.染料木黃酮對胃癌細胞侵襲轉移的抑制作用[J].營養學報,2006,28 (3):252-254.

[9]Travis RC,Spencer EA,Allen NE,et al.Plasma phytoestrogens and prostate cancer in the European Prospective Investigation into Cancer and Nutrion[J].Br J Cancer,2009,100 (11):1817-1819.

[10]周樂,趙曉莉,狄留慶,等.黃酮類化合物口服吸收與代謝特征及其規律分析[J].中草藥,2013,44 (16):2313-2320.

[11]戴立言,王曉鐘,陳英奇.異黃酮類化合物的合成新方法[J].有機化學,2008,28 (12):2126-2131.