STAT4基因缺失增強髓系抑制性細胞動員促進小鼠炎癥相關腸癌的發生

鄒渭洪，付成效，秦旭平

(1.南華大學附屬第一醫院藥劑科，湖南 衡陽 421001；2.南華大學藥物藥理研究所)

結直腸癌是全球最常見的惡性腫瘤之一，其發病率和死亡率均位于全部腫瘤的第三位，國內結直腸癌的發病率和死亡率分別位于全國城市腫瘤的第二位和第四位。遺傳因素、膳食結構的變化、肥胖人群的顯著增多、惡劣的環境條件以及人口的老齡化等是結直腸癌發病相關的多種危險因素。炎癥和免疫細胞在消化道腫瘤的發生、發展中發揮著重要的作用，但是作用機制仍不清楚[1-2]。文獻報道內源性組胺缺失促進小鼠骨髓和脾臟內CD11b+Gr-1+不成熟髓系細胞的增殖和動員，促進小鼠結腸癌的發生[3]。但是，組胺調控不成熟髓系細胞增殖、動員和分化，參與腸癌發生的機制是否與信號轉導與轉錄激活因子4(transducer and activator of transcription 4,STAT4)有關，尚缺乏證據。因此，本研究建立STAT4基因敲除(STAT4-/-)小鼠腸癌模型，探索STAT4信號通路在髓系細胞增殖、動員和炎癥相關腸癌中的作用，為腫瘤發病機制和防治提供新思路。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

雄性STAT4-/-小鼠和野生型(WT)BaL b/c小鼠每組各20只，8～10周齡，購于南京大學模式動物研究所。

1.2 主要儀器與試劑

氧化偶氮甲烷(Azoxymethane,AOM，Sigma公司)；硫酸葡聚糖(Dextran Sulfate Sodium,DSS,分子量為36KD～50KD，MP,Biomedicals,CAT.160110)。熒光顯微鏡(日本Olympus公司)；FACScan流式細胞儀(美國Becton Dickinson公司)。

1.3 方法

1.3.1 小鼠結腸癌模型的建立 氧化偶氮甲烷(Azoxymethane，AOM)是一種特異的引起腸道上皮細胞基因突變的化學試劑，硫酸葡聚糖(DSS)可以引起小鼠的急性潰瘍性結腸炎[4]。8～10周齡的雄性STAT4-/-小鼠和WT小鼠，每組各20只。實驗組STAT4-/-和WT小鼠(各10只)首先腹腔注射一次AOM(12 mg/kg體重)，在AOM注射后一周，給予含3％DSS的飲用水，7天后更換為正常飲用水。對照組STAT4-/-和WT小鼠(各10只)給予一次200 μL PBS腹腔注射，飲用水為消毒純凈水。然后，分別在AOM+DSS處理后早期(10周)和晚期(20～24周)檢測小鼠腸道中腫瘤的數目和大小(腫瘤直徑≥3 mm為大腫瘤，<3 mm為小腫瘤)。腸癌病變組織HE染色后的進行病理分析，包括結腸腫瘤的病理分型和炎性細胞浸潤評分。

1.3.2 流式細胞術(FACS)分析免疫細胞亞群 麻醉處死小鼠，收集外周抗凝血、脾臟和骨髓細胞。方法簡述如下：抽取外周血約800 μL，抗凝處理，采用紅細胞裂解液(RBC Lysis Buffer,BD)裂解紅細胞備用；脾臟組織剪取小塊(黃豆大小)，在存在BD的40 μm濾網上研磨后，PBS沖洗收集；隨后分離股骨，采用含2％胎牛血清的PBS沖洗骨髓腔，經40 μm濾網過濾收集洗脫液。細胞計數后(1×106cell/100 μL)，分別加入CD11b、Gr-1、Ly6C、Ly6G等熒光標記抗體(BD Bioscience公司)。FACS檢測骨髓、脾臟和外周血CD11b+Gr-1+MDSCs、單核系(CD11b+Ly6C+)的百分比變化，進行固有免疫細胞動員分析。

1.4 統計學分析

實驗數據用均數±標準差表示，每組樣本數(n)為5，統計分析采用應用SPSS 13.0軟件進行t檢驗,以P<0.05為差異具有顯著性。

2 結 果

2.1 小鼠結腸癌模型的建立和STAT4基因缺失對腸癌發生的影響

STAT4-/-和WT組小鼠在早期和晚期的腸道病變如圖1所示，在AOM和DSS共同處理10周(早期)，STAT4-/-小鼠可以在結腸的中下段和肛門處發現直徑在1～2 mm的腸瘤樣病變(或腸上皮異常增生)，而對照的WT小鼠只能發現在結腸的中下段和肛門處有炎性病變和上皮組織增生。在20周(晚期)，STAT4-/-小鼠可以在結腸的中下段和肛門處發現直徑在3～5 mm的大型腸瘤樣病變，較對照組WT小鼠的腫瘤數量和大小均明顯增多。對腫瘤組織的病理分析顯示(圖2)，STAT4-/-小鼠的腸瘤的上皮組織分化程度較低，腸道上皮特有的杯狀細胞(goblet cell)較WT小鼠的腸瘤組織明顯減少。實驗結果顯示，STAT4基因缺失，可以顯著增強STAT4-/-小鼠對AOM和DSS誘導腸癌發生的敏感性和促進腫瘤生長。

2.2 STAT4基因缺失增強損傷組織的炎癥反應

為了研究STAT4信號通路在DSS引起的潰瘍性腸炎中的作用，我們檢測了小鼠引用DSS水7天后腸道的早期炎癥反應。小鼠出現體重減輕、腹瀉、血便等急性腸炎的表現。如圖3病理學切片HE染色發現所示，STAT4-/-小鼠的結腸中下段上皮水腫，小鼠病變結腸上皮組織腺體結構紊亂，黏膜和黏膜下有大量單核細胞和中性粒細胞浸潤。這提示STAT4缺失不僅促進固有免疫細胞的動員和分化，而且可以促進免疫細胞對腸道損傷組織的浸潤，加重炎癥反應。

圖1 大體解陪顯示STAT4基因缺失促進結腸腫瘤的發生和發展

圖2 HE組化染色顯示瘤變組織中作為上皮分化標識的杯狀細胞(×200)

2.3 STAT4缺失促進髓系抑制性細胞MDSCs的分化和動員

應用髓系細胞標識CD11b和中性粒細胞標識Gr-1+鑒別髓系免疫細胞。如圖4流式分析結果所示，CD11b+Gr-1+MDSCs在STAT4-/-小鼠的外周血較對照組WT小鼠顯著增加(外周血6.8±2.1％ vs 2.2±0.3％，P<0.05)。脾臟和骨髓內的百分比較WT小鼠均增加(脾臟3.2±1.1％ vs 2.6±0.5％；骨髓48±12％ vs 39±9.1％，P<0.05)。

3 討 論

腸癌的發生與反復遷延的腸道慢性炎癥(目前也常稱作非可控性炎癥)有密切關系，但是對于炎癥反應和免疫細胞在結腸腫瘤發生、發展中的作用機制尚未完全闡明[5]。建立高效、穩定的、與炎癥相關的小鼠腸癌實驗動物模型，將為闡明炎癥反應和免疫細胞在腸道腫瘤的發生、發展中的作用及分子機制，為探索、開發抗腫瘤相關藥物，提供高效的研究分析平臺。氧化偶氮甲烷(AOM)是一種特異的引起腸道上皮細胞基因突變的化學試劑，其病變主要發生在結腸。硫酸葡聚糖(DSS)可以引起小鼠的潰瘍性結腸炎。已有研究表明，不同分子量的DSS所誘導的腸炎病變特征不同，如分別用5KD,40KD和500KD分子量的DSS喂養小鼠，結果典型結腸炎病變只出現于5KD組和40KD組，50KD組的病變主要見于盲腸和上段結腸。DSS結腸炎的嚴重度并不完全依賴于DSS攝入總量，而主要是由DSS濃度決定[4]。在本研究中，我們應用AOM和DSS處理STAT4-/-小鼠，建立了高效、敏感的炎癥相關小鼠結腸癌模型。此外，我們在預實驗也發現小鼠不同種屬對于DSS的敏感度不一，Balb/c小鼠較C57/B6小鼠對AOM和DSS刺激更敏感，成瘤率更高。

STAT分子家族是一類有著共同重要功能特點的轉錄因子，其分子結構特點有：一個N基末端的STAT二聚化結構域、一個DNA結合域、一個Src同源結構域(SH2)、一個保守的酪氨酸殘基和一個C基末端的反式激活結構域[6-7]。目前已經被證實的STAT家族成員有7個，分別是STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5A、STAT5B和STAT6。研究發現STAT4是T淋巴細胞、NK細胞、樹突狀細胞和巨噬/枯否細胞等免疫調控細胞內IL-12/STAT4/IFN-γ信號傳導途徑的關鍵組成元件，是IL-12誘導免疫調控細胞產生IFN-γ的關鍵調控因子[7]。在STAT4-/-小鼠，IL-12誘發的所有主要的T細胞和NK細胞功能反應均明顯減弱，其中包括IFN-γ產生減少與Th1型反應減弱，而STAT4的這一作用有可能是通過p38MAPK途徑介導的[8]。但是當前對STAT家族在固有免疫細胞增殖和分化中的作用及分子機制研究尚有待加強和深入。

圖3 HE組化染色顯示STAT4基因缺失促進大量免疫細胞浸潤炎癥組織(×200)

圖4 流式細胞分析檢測CD11b+Gr-1+MDSCs在外周血、脾臟和骨髓的表達(FACS代表圖)

髓系抑制性細胞MDSCs(小鼠的常用細胞標識為CD11b+Gr-1+，而人的CD14+CD33+CD11b+)是來源于骨髓的一大類異構細胞的總稱，包括單核系、粒系細胞和髓系前體細胞，具備向中性粒細胞、單核/巨噬細胞或者樹突狀細胞分化的能力[9]。CD11b+Gr-1+MDSCs在急慢性感染、自身免疫疾病和腫瘤發生中發揮了重要作用[10]。我們的研究進一步揭示STAT4在CD11b+Gr-1+MDSCs有較高水平的表達；STAT4缺失促進MDSCs的增殖和動員，增強由DSS引起的腸道炎癥反應。研究發現[3]，小鼠骨髓和脾臟有大量的CD11b+Gr-1+不成熟髓系細胞(immature myeloid cells,IMCs)，與MDSCs具有一樣的細胞表面識別標識。這些不成熟髓系細胞與炎癥相關的小鼠結腸癌和皮膚癌的發展密切相關，其向巨噬細胞的分化與內源性組胺的表達有關[11-12]。最近的研究發現，在MDSCs的發育中，STAT/IRF-8軸扮演著重要的角色。我們研究證實STAT4缺失促進腸癌的發展，與STAT4信號通路調節MDSCs的增殖、分化和動員有關。STAT4信號通路與組胺信號通路是否存在“對話”(cross talk)還有待更多的研究[13]。

綜上所述，本研究應用STAT4基因敲除小鼠，通過AOM+DSS處理誘導建立了一種敏感的炎癥相關結腸癌實驗動物模型，揭示了STAT4信號通路在CD11b+Gr-1+MDSCs增殖、分化和動員中的作用；STAT4缺失導致的信號阻抑顯著增強小鼠炎癥相關結腸腫瘤的發生和發展。以STAT4信號通路及其上下游調控因子為靶標，可能為結腸腫瘤的發生機制和藥物開發研究提供新的靶點。

[1]Fridlender ZG,Sun J,Kim S,et al.Polarization of tumor-associated neutrophil phenotype by TGF-beta:“N1” versus “N2” TAN[J].Cancer Cell 2009，16(3)：183-194.

[2]Youn JI,Nagaraj S,Collazo M,et al.Subsets of myeloid-derived suppressor cells in tumor-bearing mice[J].J Immunol,2008，181(8):5791-5802.

[3]Yang XD,Ai W,Asfaha S,et al.Histamine deficiency promotes inflammation-associated carcinogenesis through reduced myeloid maturation and accumulation of CD11b+Ly6G+immature myeloid cells[J].Nat Med,2011,17(1):87-95.

[4]Tanaka T,Kohno H,Suzuki R,et al.A novel inflammation-related mouse colon carcinogenesis model induced by azoxymethane and dextran sodium sulfate[J].Cancer Sci,2003，94(11):965-973.

[5]Ullman TA,Itzkowitz SH.Intestinal inflammation and cancer[J].Gastroenterology,2011，140(6):1807-1816.

[6]Pfitzner E,Kliem S,Baus D,et al.The role of STATs in inflammation and inflammatory diseases[J].Curr Pharm Des,2004,10(23):2839-2850.

[7]Morinobu A,Gadina M,Strober W,et al.STAT4serine phosphorylation is critical for IL-12-induced IFN-gamma production but not for cell proliferation[J].Proc Natl Acad Sci USA,2002，99(1):12281-12286.

[8]Visconti R,Gadina M,Chiariello M,et al.Importance of the MKK6/p38 pathway for interleukin-12-induced STAT4serine phosphorylation and transcriptional activity[J].Blood，2000，96(5):1844-1852.

[9]Bronte V.Myeloid-derived suppressor cells in inflammation:uncovering cell subsets with enhanced immunosuppressive functions[J].Eur J Immunol,2009,39(10):2670-2672.

[10]Peranzoni E,Zilio S,Marigo I,et al.Myeloid-derived suppressor cell heterogeneity and subset definition[J].Curr Opin Immunol,2010，22(2):238-244.

[11]Swirski FK,Nahrendorf M,Etzrodt M,et al.Identification of splenic reservoir monocytes and their deployment to inflammatory sites[J].Science,2009，325 (5940):612-616.

[12]Wang KY,Tanimoto A,Guo X,et al.Histamine deficiency decreases atherosclerosis and inflammatory response in apolipoprotein E knockout mice independently of serum cholesterol level[J].Arterioscler Thromb Vasc Biol,2011,31 (4):800-807.

[13]Jutel M,Klunker S,Akdis M,et al.Histamine upregulates Th1 and downregulates Th2 responses due to different patterns of surface histamine 1 and 2 receptor expression[J].Int Arch Allergy Immunol,2001，124(1-3):190-192.