miR-19b對巨噬細胞ABCA1表達的影響

呂運成，彭 超，姚 峰，唐艷艷，張 熠，徐 菁，劉政海，唐朝克

(1.南華大學醫學院心血管疾病研究所；2.南華大學臨床應用解剖研究室，湖南 衡陽 421001；3.南華大學附屬第一醫院臨床研究所)

miR-19b為一種內生性的microRNA，在哺乳動物體內存在兩種亞型(miR-19b-1與miR-19b-2)，分別由13號常染色體和X染色體產生，但兩者序列完全相同。miR-19b在心肌細胞、單核細胞及血管內皮細胞中均有表達，在人和鼠As斑塊中過量表達[1-3]。高脂飲食上調miR-19b表達，促進皮下和內臟脂肪的沉積[4]。這些研究初步提示miR-19b可參與調控脂質代謝，與動脈粥樣硬化(atherosclerosis，As)的進展密切相關。

生物信息學分析發現miR-19b可靶向結合三磷酸腺苷結合盒轉運體A1 (ATP binding cassette transporter A1，ABCA1)3′ 非編碼區(3′ untranslated region，3′ UTR)，且二者結合的自由能較低。人ABCA1 3′ UTR存在三個miR-19b結合位點，鼠ABCA1 3′ UTR存在兩個結合位點。這就提示miR-19b可靶向調控細胞內ABCA1表達，而ABCA1介導脂質流出對抑制巨噬細胞內脂質蓄積和AS進展起著關鍵作用[5]。本研究將采用Western blot、熒光定量PCR等技術檢測miR-19b對THP-1源性巨噬細胞ABCA1的mRNA及蛋白水平的影響，證實miR-19b是否調控巨噬細胞ABCA1的表達。

1 材料與方法

1.1 主要材料

人單核細胞株THP-1購自中國科學院上海生物化學與細胞生物學研究所細胞庫。RPMI1640培養基購自Solarbio公司，胎牛血清購自杭州四季清生物公司，牛血清白蛋白購自上海生工。佛波酯(phorbol 12-myristate 13-acetate，PMA)購自北京諾博萊德公司。miR-19b mimic/inhibitor及riboFECTTMCP轉染試劑盒均購自廣州銳博公司。ABCA1抗體購自ABCam公司，β-actin抗體購自武漢博士德公司。Trizol及反轉錄試劑盒均購自Invitrogen公司。熒光定量PCR試劑盒購自康為世紀公司。其他試劑均為國產分析純。

1.2 細胞培養與轉染

THP-1 細胞用含10％胎牛血清的RPMI 1640培養液培養，37 ℃、5％CO2及飽和濕度的培養箱中靜置培養。將THP-1細胞種植到六孔板，用160 nM PMA孵育細胞24 h，使其誘導分化成巨噬細胞。實驗前制備miRNA轉染復合液：miR-19b mimic為250 μL buffer+4 μL mimic+25 μL reagent+1721 μL無血清培養液(mimic終濃度為40 nM)，miR-19b inhibitor為250 μL buffer+8 μL inhibitor+25 μL reagent+1717 μL無血清培養液(inhibitor終濃度為80 nM)。棄去舊培養液后加入轉染復合液，轉染48h后收集細胞。

1.3 Western blot

收集處理后的細胞，加入RIPA裂解液冰上裂解30 min，4 ℃離心10 min，棄去沉淀。以4∶1加入5×SDS凝膠加樣緩沖液，100 ℃加熱10 min。10％SDS聚丙烯酰胺凝膠進行電泳分離，12V恒壓半干轉膜45 min后，麗春紅染色5 min觀察轉膜效果。5％脫脂牛奶封閉2h，按1∶1000加入羊抗人ABCA1一抗，4 ℃孵育過夜，TBST洗3次，1∶1000 加入辣根過氧化物酶標記的小鼠抗羊二抗，室溫孵育2 h，TBST洗3次，用Tanon 5500免疫熒光檢測系統激發熒光，Tanon MP軟件攝取圖像，Tanon CAL軟件分析獲取各條帶的光密度值。

1.4 熒光定量PCR

用trizol試劑分別提取各組細胞的總RNA，用反轉錄試劑盒將總RNA反轉錄成cDNA，用LightCycler480熒光定量PCR儀進行實時定量PCR，反應體系為50 μL，含2×UltraSYBR Mixture 25 μL、上下游引物各1 μL、cDNA 2 μL，buffer 21 μL。95 ℃預變性10 min后，再按95 ℃ 15 s、60 ℃ 1 min共40個循環。收集60 ℃時的熒光信號。人ABCA1引物為，5′-GGTTTGGAGATGGTTATACAAT AGTTGT-3′和5′-CCCGGAAACGCAAGTC C-3′。β-actin的表達用作內參照。

1.5 統計學處理

2 結 果

2.1 miR-19b對巨噬細胞ABCA1蛋白水平的影響

將THP-1巨噬細胞分為3組：(1)空白對照組，培養液中不加任何其他物質；(2)miR-19b mimic組：培養液中加入40 nM/L miR-19b mimic；(3)miR-19b inhibitor組：培養液中加入80 nM/L miR-19b inhibitor。miR-19b mimic組ABCA1蛋白表達較空白對照組明顯降低。miR-19b inhibitor組ABCA1蛋白表達與空白對照組比較明顯上調。這就表明miR-19b可抑制巨噬細胞ABCA1蛋白的表達(圖1)。

圖1 轉染miR-19b mimic及其inhibitor 24 h后THP-1巨噬細胞ABCA1 mRNA蛋白表達的變化

2.2 miR-19b對巨噬細胞ABCA1 mRNA水平的影響

將THP-1巨噬細胞分組如上。miR-19b mimic組ABCA1 mRNA水平較空白對照組明顯降低。miR-19b inhibitor組ABCA1 mRNA水平與空白對照組比較無變化。這就表明miR-19b可下調巨噬細胞ABCA1 mRNA的水平(圖2)。

3 討 論

巨噬細胞ABCA1的表達水平受到胞內各種調控因子的嚴密調控[6-7]。本研究采用Western blot和熒光定量PCR檢測了miR-19b對巨噬細胞ABCA1蛋白及其mRNA水平的影響，結果發現miR-19b顯著抑制巨噬細胞ABCA1的表達。

圖2 轉染miR-19b mimic及其inhibitor 24h后THP-1巨噬細胞ABCA1mRNA表達的變化

MiR-19在轉錄后水平抑制巨噬細胞ABCA1的表達。我們在前期的生物信息學分析中發現miR-19b可直接靶向作用ABCA1 3′UTR，且二者結合的自由能較低，這就提示miR-19b可在生理或者病理條件下調控ABCA1的表達。本研究在人源性THP-1巨噬細胞中轉染miR-19b mimic與inhibitor，從而增強或抑制miR-19b的功能，結果發現ABCA1蛋白及其mRNA水平均下調。這些結果與生物信息學預測分析一致，并且在體外細胞水平證實了miR-19b對ABCA1表達的調控作用。

miR-19b下調巨噬細胞ABCA1的表達對As的發生發展具有重要意義。ABCA1在介導巨噬細胞內脂質流出及HDL生成中起著關鍵作用[8]。抑制ABCA1的表達與功能導致巨噬細胞內脂質蓄積和膽固醇逆向轉運(reverse cholesterol transport，RCT)受阻，從而導致血管壁脂質沉積和As的發生發展。已有研究表明miR-19b在人As斑塊中高表達，而在正常動脈壁上無表達。這就提示miR-19b抑制ABCA1表達參與了As發生發展的過程。

本研究初步證實了miR-19b調控巨噬細胞ABCA1的表達，但是miR-19b對ABCA1的具體調控機制、體內驗證miR-19b的調控作用及其對巨噬細胞脂質流出和As發生發展的影響有待進一步研究?？傊?，全面揭示miR-19b對ABCA1的調控作用及其機制，使其有望成為調控RCT及防治AS的新靶點。

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