PEITC通過抑制結腸癌細胞PI3K/NF-κB活性而抑制MMP-9表達

魏付橋，申清香，劉昌化，羅康寧，謝文彪，胡 軍

(1.南華大學附屬第二醫院胃腸外科；湖南 衡陽 421001；2.南華大學附屬第二醫院婦產科；3.南華大學附屬第二醫院心胸外科)

結腸癌是消化系統最常見的惡性腫瘤，全世界每年新發病例可達120萬人以上，在我國，由于飲食結構的改變，其發病率也有逐年遞增的趨勢。結腸癌起病隱匿，90％以上患者死于癌細胞的侵襲和轉移[1]。腫瘤細胞從原發灶脫落，并降解細胞外基質(extracellular matrix,ECM)是腫瘤發生轉移的最重要病理生理改變，而此過程與基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)的活性密切相關[2]。因此，以MMPs為研究靶點，探索抑制MMPs活性的治療藥物，對結腸癌的治療具有重要意義。

異硫氰酸苯乙酯(phenethyl isothiocyanate,PEITC)異硫氰酸脂的一種，廣泛存在于橄欖，花椰菜等十字花科植物當中。研究顯示，PEITC可通過多種機制腫瘤細胞的生長與增殖，如PEITC可與β-微管蛋白結合，促進微管蛋白的穩定而影響細胞有絲分裂[3]。也能抑制去乙酰化酶的活性而影響染色質功能[4]。本文旨在觀察PEITC對結腸癌SW480細胞的遷移與侵襲有何影響，并探討其可能的調控機制。

1 材料與方法

1.1 實驗試劑

PEITC購自LKT Laboratories(純度≥95％)，并用二甲基亞砜溶解。細胞培養基為Invitrogen產品，培養板和Transwell小室購自Corning。Trizol試劑購自Invitrogen公司。RT-PCR試劑盒購自大連寶生物。抗MMP-9和β-actin抗體購自Santa Cruz。磷酸化Akt，總Akt抗體購自Cell Signaling。ECL化學發光試劑盒購自Amersham Pharmacia。NF-κB熒光素酶報告基因購自SABioscicence，雙重熒光素酶實驗系統購自Promega。pGL3-basic載體和DNA轉染試劑購自Invitrogen。

1.2 細胞培養

SW480細胞株購自中南大學腫瘤研究所，用含10％胎牛血清的RPMI-1640培養基于37 ℃，5％ CO2條件下培養。分別設立對照組(加入等體積的二甲基亞砜)及不同濃度PEITC處理組(加入終濃度為10、30、50 μmol/L的PEITC作用24 h)。采用MTT觀察PEITC對SW480細胞的增殖情況，即，SW480孵育結束后，每孔加入30 μL MTT溶液(1 mg/mL)孵育2 h。棄上清，并加入200 μL二甲基亞砜，充分混勻，用酶標儀測定各孔的吸光度值(OD570)，并計算抑制率。抑制率=(對照組OD值-實驗組OD值)/對照組OD值×100％。

1.3 RT-PCR檢測MMP-9 mRNA表達

采用Trizol提取RNA，并根據試劑盒提供的步驟進行逆轉錄PCR(reverse transcription-PCR,RT-PCR)。PCR反應條件如下：94 ℃變性30 s，65 ℃(MMP-9)或59 ℃(GAPDH) 30 s，72 ℃延伸30 s。隨后進入40(MMP-9)或35(GAPHD)個擴增循環。其中MMP-9引物分別為5′-CGCTACCACCTCGAACTTTG-3′和5′-GCCATTCACGTCGTCCTTAT-3′，產物196 bp。GAPDH：5′-TCACCATCTTCCAGGAGCGA-3′，5′-CACAATGCCGAAGTGGTCGT-3′，產物700 bp。擴增產物隨后經2％瓊脂糖凝膠電泳，并采用Image J軟件進行灰度分析并計算兩者比值。

1.4 劃痕愈合實驗

通過劃痕愈合實驗測定細胞的遷移能力。即，5×106細胞接種于6孔板中37 ℃培養6 h。待細胞呈單層貼壁生長后，用200 μL的移液管尖端在板上劃痕。PBS洗滌后加入含有PEITC的完全培養基孵育24 h。在顯微鏡下拍照并計算遷移率：(1-處理后劃痕距離/對照組劃痕距離)×100％。

1.5 侵襲性實驗

將基質膠均勻鋪至Transwell小室上室，并加入100 μL細胞懸液(106/mL)，下室加入500 μL完全培養基，37 ℃孵育24 h。取出Transwell，多聚甲醛固定，風干后加入0.1％結晶紫染色20 min。擦除上室細胞，顯微鏡下隨機選擇視野拍照，計算遷移到下腔表面的細胞數。其中侵襲抑制率=(1-樣本穿膜細胞數/對照組穿膜細胞數)×100％。

1.6 Western blot

根據試劑盒提供的步驟提細胞總蛋白并測定其濃度。獲取100 μg蛋白用于SDS-PAGE。分離的總蛋白或核蛋白隨后轉印至PVDF膜上(Millipore)，并利用含5％脫脂牛奶的TBST封閉1 h，隨后加入一抗抗體4 ℃孵育過夜。多次洗滌之后，加入HRP標記的二抗孵育膜1 h。ECL法(Amersham)發光、顯影。

1.7 瞬時轉染和熒光素酶報告基因分析

獲取MMP-9基因(基因ID：D10051)上游-720 bp～-11 bp啟動子區域序列，用PCR克隆至pGL3-basic載體中，構建pGL3-MMP-9-luc報告基因質粒。SW480細胞接種于6孔板中，當其密度達視野的70％～80％時，共轉入0.2 μg pGL3-MMP-9-luc(或NF-κB-luc)報告基因質粒以及0.2 μg pSV-β-半乳糖苷酶并培養18 h。隨后細胞加入不同濃度PEITC作用24 h，根據試劑盒(Promega)提供的操作步驟，采用光測定儀(Turner BioSystems，Luminometer 20/20n)獲取螢光素酶和β-半乳糖苷酶活性。以β-半乳糖苷酶活性為內參，計算螢光素酶活性的相對值。

1.8 統計學分析

2 結 果

2.1 PEITC抑制SW480細胞的遷移和侵襲

MTT結果顯示，10～50 μmol/L PEITC處理對細胞的活性無明顯影響(結果未顯示)。而劃痕愈合實驗顯示，10、30和50 μmol/L PEITC處理SW480細胞后，細胞遷移率分別為(64.27±5.14)％，(51.57±4.39)％和(43.81±3.61)％，與對照組相比，差異均有顯著性。Transwell結果顯示，不同濃度的PEITC也能呈劑量依賴性方式抑制SW480細胞侵襲(圖1，表1)。

圖1 PEITC抑制SW480細胞遷移和侵襲(×10)

表1 PEITC對SW480細胞的遷移率和侵襲率(％)

2.2 PEITC抑制SW480細胞MMP-9蛋白及mRNA表達

RT-PCR結果顯示，SW480細胞未處理前，MMP-9 mRNA表達水平較高，經不同濃度PEITC處理后，其mRNA水平隨著濃度的增高而降低(圖2A)。Western blot結果也顯示，10～50 μmol/L PEITC處理后，MMP-9蛋白含量逐漸降低(圖2B)。

2.3 PEITC抑制PI3K/NF-κB通路的活性

Western blot結果顯示，PEITC處理后，SW480細胞中磷酸化Akt水平明顯降低，而總Akt無明顯影響(圖3A)。此外，報告基因結果顯示，PEITC也能影響NF-κB-luc的轉錄活性，同時，采用20 μmol/L PI3K抑制劑LY294002處理后，NF-κB-luc活性顯著降低(圖3B)。

圖3 PEITC對PI3K/NF-κB活性的影響

2.4 PEITC經PI3K/NF-κB抑制MMP-9的表達與轉錄

Western blot顯示，PI3K抑制劑LY294002和NF-κB抑制劑PDTC處理SW480細胞后，MMP-9表達顯著降低。此外，報告基因顯示，不同濃度PEITC處理能顯著抑制MMP-9的啟動子活性，從而抑制MMP-9的轉錄(圖4A)。

圖4 PEITC對MMP-9表達及轉錄活性的影響

3 討 論

對于結腸癌而言，癌細胞的局部浸潤以及遠處轉移是患者治療失敗和死亡的首要原因。癌細胞在浸潤性生長過程中，細胞基質的降解是癌細胞從原發部位脫落，并經淋巴結或血液轉移的關鍵。而MMP-9在其中發揮至關重要作用。因此，預防或抑制癌細胞浸潤和轉移在很大程度上可提高癌癥患者的生存率。有研究顯示PEITC能抑制前列腺癌、乳腺癌以及肺癌細胞肺轉移[5]，然而，PEITC對結腸癌的抑制作用尚未完全清楚，本研究證實PEITC在無細胞毒性的濃度范圍內能明顯抑制SW480細胞的浸潤和轉移，并能明顯抑制明膠酶活性和MMP-9的表達，這表明PEITC在結腸癌中通過抑制MMP-9的表達和活性而具有抗侵襲的潛能。

PI3K是一種脂質激酶，通過激活Akt(即蛋白激酶B)控制多種生理過程，它通過誘導P21WAF1定位于細胞質，并通過滅活前凋亡因子BAD和caspase-9發揮抗凋亡作用，此外，活化的Akt可通過誘導MMPs的表達而促進癌細胞侵襲和轉移[6]。研究顯示，MMP-9 mRNA含量與PI3K的活性成正相關[7]。本研究也證實，PEITC能抑制PI3K產物Akt磷酸化，從而抑制MMP-9的表達。NF-κB是Akt下游通路的重要靶分子。并參與調控MMP-9的表達，并與炎癥、腫瘤細胞增殖、浸潤和轉移密切相關[8]。此外，NF-κB在多種腫瘤細胞中持續激活，并誘導多種抗凋亡蛋白表達而導致化療/放療耐受[9]。因此抑制NF-κB的活性可能有利于提高藥物的療效。本研究結果顯示，PEITC可有效抑制NF-κB轉錄活性。由于MMP-9的啟動子區域存在NF-κB的結合位點[10]，因此本研究構建了MMP-9啟動子序列的報告基因，結果也證實，PEITC可通過影響PI3K/NF-κB的活性，從而抑制MMP-9的轉錄激活作用。

總之，本研究證明PEITC具有抑制SW480細胞浸潤的能力。其機制可能通過抑制PI3K/ NF-κB信號通路的活性而抑制MMP-9表達。由于PEITC來源于可食用天然植物[11]，這無疑為腫瘤的預防和治療提供了重要參考，長期食用PEITC含量豐富的蔬菜可降低腫瘤發生的風險，此外，PEITC有望成為結腸癌的重要輔助治療藥物。

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