大孔樹脂分離純化陳皮中多甲氧基黃酮類化合物

劉 韶，陽秀娟

1中南大學湘雅醫院藥學部，湖南長沙 410008;2 桂林醫學院附屬醫院臨桂院區藥劑科，廣西桂林 541100

陳皮是蕓香科柑橘屬植物橘(Citru reticulataBlaneo)及其栽培變種的干燥成熟果皮［1］，其性溫、辛、味苦，歸肺、脾經，具有理氣健脾、燥濕化痰的功效［2］。陳皮中含有多種多甲氧基黃酮類成分，其中川陳皮素和橘皮素含量較高。近年來發現多甲氧基黃酮類成分具有抗癌、抗腫瘤、抗炎、抗氧化、抗誘變等生物活性逐漸成為熱點［3-5］，因此，對含多甲氧基黃酮陳皮進行純化研究很有必要。但該類研究報道不多［6，7］，多研究其所含的另一類黃酮，如陳皮苷。大孔樹脂是一種多孔的聚合物吸附劑，現已廣泛應用于中藥中有效部位的純化研究［7］，本文以川陳皮素和橘皮素為評價指標，篩選陳皮中多甲氧基黃酮類的大孔樹脂分離純化工藝。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

電子天平(德國Sartorius 公司);旋轉蒸發儀(鄭州長城R-1001N);恒溫水浴鍋(余姚市亞星儀器儀表有限公司);Agilent-1100 型液相色譜儀器(包括G1311A 四元梯度泵、G1313A 自動進樣器、G1311A 柱溫箱、G1313A 二極管陣列檢測器，美國安捷倫科技有限公司)。

陳皮(產地:江西，批號:201207061)，經中南大學湘雅醫院藥學部劉韶主任藥師鑒定為蕓香科柑橘屬植物橘(Citru reticulataBlaneo)的干燥成熟果皮;D101 型大孔吸附樹脂(天津市光復精細化工研究所);DM130 型大孔吸附樹脂(滄州寶恩吸附材料科技有限公司);川陳皮素和橘皮素對照品(陜西永健制藥有限公司，純度≥98%);乙腈(色譜純);乙醇(分析純);純化水(自制)。

1.2 川陳皮素和橘皮素的含量測定

1.2.1 色譜條件［8，9］

色譜柱為XB-C18(5 μm，4.6 mm ×250 mm);流動相為乙腈-水(50∶50);流速為1.0 mL/min;檢測波長330 nm;柱溫為25 ℃;進樣量為10 μL。

1.2.2 對照品溶液的制備和標準曲線的繪制

精密量取川陳皮素標準品25 mg，置50 mL 容量瓶中，加適量無水乙醇，使之溶解，再加無水乙醇定容至刻度，搖勻、即可。精密量取川陳皮素標準溶液1、2、4、6、8、10 mL 分別置10 mL 容量瓶中，各加無水乙醇混勻，再定容至刻度、搖勻。用HPLC 測定峰面積，以峰面積為縱坐標，濃度為橫坐標繪制標準曲線，得線性方程。

精密量取橘皮素標準品12.5 mg，置25 mL 容量瓶中，加適量無水乙醇，使之溶解，再加無水乙醇定容至刻度、搖勻，即可。精密量取橘皮素標準溶液0.2、0.5、1、2、3、4 mL 分別置10 mL 容量瓶中，各加無水乙醇混勻，再定容至刻度、搖勻。用HPLC 測定峰面積，以峰面積為縱坐標，濃度為橫坐標繪制標準曲線，得線性方程。

1.2.3 樣品溶液的制備

稱取陳皮藥材500 g，以85%的乙醇10 倍量提取2 次，每次提取1h，過濾，合并濾液，將濾液旋轉蒸發，回收乙醇，再用30%乙醇溶解，并定容至1000 mL 作為樣品液，放冰箱(4 ℃)中備用。

1.2.4 精密度、穩定性、重現性試驗

取同一對照品溶液，重復進樣6 次，測定川陳皮素、橘皮素的峰面積，計算精密度的RSD。取供試品溶液，自溶液配制后分別在0、2、4、8、12、24 h 各進樣10 μL，測定川陳皮素、橘皮素峰面積，計算穩定性的RSD。精密稱定陳皮粉末6 份，每份約1 g，按“1.2.3”項下方法處理，進行重現性實驗，以峰面積計算，得到川陳皮素、橘皮素峰面積的RSD。

1.3 大孔樹脂預處理

將未處理的大孔樹脂用適量95%乙醇浸泡過夜，倒出乙醇，用純化水洗，并濕法裝柱，再用純化水洗至流出液無醇味，備用。

1.4 大孔樹脂的種類篩選

將已預處理的D101、DM130 型大孔樹脂分別稱取1 g 于帶磨口塞的錐形瓶中，各加入適量陳皮樣品液，靜置過夜，過濾后得吸附后溶液。往過濾后的樹脂中，各加95%乙醇適量，靜置過夜，過濾后得解吸后溶液。重復試驗3 次，用HPLC 法測定各樣品中的川陳皮素和橘皮素，按下式分別計算吸附量和解吸率。

式中:C、V 分別是陳皮樣品液的濃度(mg/mL)和體積(mL)，C1、V1 分別是吸附后溶液的濃度(mg/mL)和體積(mL)，M 是樹脂的質量(g)，C2、V2 分別是解吸液的濃度(mg/mL)和體積(mL)［6］。

1.5 洗脫劑乙醇濃度的確定

取約20 g 已預處理的D101 型大孔樹脂3 份，濕法裝柱，取陳皮樣品液70 mL 上柱，用2 BV 水和3 BV 30%乙醇分別洗脫除去雜質，再將第一份樹脂柱用6 BV 70%乙醇繼續洗脫，第二份樹脂柱用6 BV 80%乙醇繼續洗脫，第三份樹脂柱用6 BV 95%乙醇繼續洗脫，分別吸取每份的上樣液、流出液和洗脫液測定，按文獻方法［10］計算川陳皮素、橘皮素的吸附量及洗脫率。

1.6 洗脫劑用量的考察

取約20 g 已預處理的D101 型大孔樹脂濕法裝柱，取陳皮樣品液70 mL 上柱，用2 BV 水和3 BV 30%乙醇分別洗脫除去雜質，再用6 BV 80%乙醇洗脫，每2 BV 一份，共3 份。依次吸取上樣液、流出液和洗脫液測定，并計算川陳皮素、橘皮素的洗脫率。

1.7 上樣液濃度的考察

取約20 g 已預處理的D101 樹脂兩份分別濕法裝柱，將質量濃度為167 mg/mL 和500 mg/mL 的陳皮樣品液上柱，吸附過夜后，先用2 BV 水和3 BV 30%乙醇分別洗脫除去雜質，再用6 BV 80%乙醇洗脫，流速1.5 mL/min。依次吸取上樣液、流出液和洗脫液測定并計算川陳皮素和橘皮素的吸附量及洗脫率。

1.8 工藝重復性考察

按確定好的吸附、洗脫條件，重復實驗三次，依次吸取流出液和洗脫液測定，計算川陳皮素和橘皮素的吸附量、洗脫量及洗脫率。另取陳皮樣品液和三次80%乙醇洗脫液倒入已恒重好的蒸發皿中在70 ℃水浴鍋上蒸干，再放入105 ℃烘箱中烘4 h，再取出，放到干燥器中干燥1 h，稱重，計算浸膏得率(浸膏得率=浸膏量/樣品液中所含藥材的量×100%)，并測定浸膏中川陳皮素和橘皮素的含量。

1.9 樹脂重復使用次數的考察

取陳皮樣品液，按前述條件進行試驗，在同一根柱上重復操作4 次，分別測定、計算出川陳皮素和橘皮素的吸附量、洗脫量及洗脫率。

2 結果與討論

2.1 HPLC 含量測定方法學考察結果

川陳皮素和橘皮素對照品及樣品的色譜圖見圖1，從圖中可以看出，各組分分離度良好。以峰面積為縱坐標，濃度為橫坐標繪制標準曲線，求得川陳皮素和橘皮素線性方程分別為Y=17721X+15.763，R2=0.9999;Y=23898X-14.467，R2=0.9997。表明各化合物在相應范圍內線性關系良好。精密度試驗中川陳皮素和橘皮素峰面積RSD 分別為1.2%和1.1%，表明儀器精密度良好。穩定性試驗中，川陳皮素和橘皮素峰面積RSD 分別為1.5%和0.9%，表明樣品在24 h 內穩定。重復性試驗中，川陳皮素和橘皮素峰面積RSD 分別為1.4%和1.6%，表明該方法重復性良好。

圖1 川陳皮素對照品(A)、橘皮素對照品(B)及陳皮樣品(C)的HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of nobiletin (A)，tangeretin (B)and orange peel sample (C)1:川陳皮素nobiletin;2:橘皮素tangeretin

2.2 大孔樹脂類型篩選結果

D101、DM130 型大孔樹脂對陳皮樣品液中川陳皮素和橘皮素的吸附量及解吸率見表1。3 次試驗結果基本一致，2 種樹脂對川陳皮素和橘皮素的吸附量以及解析率的相對標準偏差小于1.5%。D101型大孔樹脂對川陳皮素和橘皮素的吸附量稍大于DM130 型樹脂，解吸率也高于DM130 型樹脂，因此選用D101 型大孔樹脂。

表1 不同樹脂對陳皮樣品液中川陳皮素和橘皮素的吸附量及解吸率(n=3)Table 1 The adsorption and desorption rate of different resins for nobiletin and tangeretin (n=3)

2.3 洗脫劑乙醇濃度考察結果

不同濃度乙醇的洗脫效果見表2。從表2 可知，80%乙醇和95%乙醇的洗脫效果都比較好。對于川陳皮素，80%乙醇和95%乙醇的洗脫率接近，而對于橘皮素，80%乙醇的洗脫率則較95%乙醇的洗脫率稍低，但也能達到85.9%的洗脫率。因此，綜合因素考慮選用80%乙醇。

2.4 洗脫劑用量的考察

從圖2 中可以看出，第一個2 BV 80%乙醇洗脫液中，川陳皮素洗脫率達到54.14%，橘皮素的洗脫率達到20.00%，第二個2 BV 80%乙醇洗脫液中，川陳皮素洗脫率達到39.65%，橘皮素的洗脫率達到46.84%，第三個2 BV 80%乙醇洗脫液中，川陳皮素洗脫率達到5.34%，橘皮素的洗脫率達到19.06%。即6 BV 80%乙醇洗脫后，川陳皮素總的洗脫率達到96.13%，橘皮素總的洗脫率達到85.9%，表明當80%乙醇用量為6 BV 時已基本上將這兩種多甲氧基黃酮洗脫完全，因此確定樹脂的最佳洗脫量為6 BV。

表2 洗脫劑乙醇濃度的考察結果Table 2 Effects of ethanol concentration on desorption rate of nobiletin and tangeretin

2.5 上樣液濃度的考察

D101 樹脂對不同濃度樣品溶液中的川陳皮素和橘皮素的吸附量，解吸率見表3。從表3 可以看出，500 mg/mL(以陳皮藥材計)為較佳的上樣濃度。

圖2 洗脫劑用量的考察Fig.2 Effects of eluent dosage on desorption rate of nobiletin and tangeretin

表3 上樣液濃度的考察結果Table 3 Effects of sample concentration on desorption rate of nobiletin and tangeretin

2.6 工藝重復性考察

表4 為重復實驗3 次的結果。三次實驗中，川陳皮素和橘皮素的吸附量、洗脫量及洗脫率都接近，說明在同等條件下實驗，能達到穩定的吸附和洗脫。陳皮樣品液和三次實驗中80%乙醇洗脫液的浸膏得率及浸膏中川陳皮素和橘皮素的含量見表5。從表5 的結果能夠看出，陳皮樣品液通過D101 型大孔樹脂的分離純化后浸膏得率下降，而浸膏中川陳皮素和橘皮素的含量增加。浸膏中川陳皮素的含量由純化前2.54%到純化后變為11.96%，提高了3.7倍;浸膏中橘皮素的含量由純化前1.22%到純化后變為5.11%，提高了3.2 倍。

表4 工藝重復性考察的結果Table 4 The results of process repeatability

表5 純化效果考察結果Table 5 The results of purification effect

2.7 樹脂重復使用次數的考察

樹脂重復使用次數越多，其洗脫量會下降，洗脫率也會降低。本實驗結果(表6)表明:重復使用3次，川陳皮素和橘皮素的吸附量、洗脫量及洗脫率都變化不大。使用第4 次后，川陳皮素和橘皮素的吸附量、洗脫量及洗脫率都有所下降。因此，樹脂重復使用3 次后，要進行活化處理。

表6 樹脂重復使用次數考察結果Table 6 The repeated using times of resin

3 結論

本實驗的純化目標成分是川陳皮素和橘皮素等多甲氧基黃酮類成分，紫外光分光光度法、HPLC 法均可以用來測定其含量。本實驗采用HPLC 法測定樣品中的川陳皮素和橘皮素，并以它們為評價指標，篩選大孔樹脂分離純化工藝，可信度更高、更能反映純化工藝的情況。

樹脂的類型，洗脫的濃度，洗脫劑的用量，上樣液的濃度等對川陳皮素和橘皮素等多甲氧基黃酮類成分的純化工藝影響較大。本實驗首先通過參考文獻和預實驗，并根據川陳皮素和橘皮素的結構特征和樹脂性質，排除了多種樹脂，只選用D101 型和DM130 型大孔樹脂來進行靜態吸附、解吸實驗。根據影響樹脂純化的因素，本論文還對洗脫的濃度，洗脫劑的用量，上樣液的濃度等進行了考察，確定D101 型大孔樹脂為較佳的吸附樹脂，最佳工藝條件為:洗脫劑為80%乙醇，洗脫劑用量為6 BV，最佳上樣液濃度為500 mg/mL。經過處理后川陳皮素和橘皮素的純度分別提高了3.7 倍和3.2 倍。

本實驗操作簡單，實驗成本較低，經濟環保且能達到較好的分離純化效果，能用于陳皮中多甲氧基黃酮類化合物的分離純化。

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