芹菜素對大鼠睪丸標志酶及氧化還原平衡的影響

陳文材，劉玲飛，吳 雙，劉佳微，黨瑜慧，張 潔，李芝蘭

蘭州大學公共衛生學院，蘭州 730000

芹菜素(Apigenin，AP)是一種常見的黃酮類化合物，具有廣泛的生物學功能和藥理作用，與其他黃酮類化合物相比具有低毒、低誘變性等特點。現階段國內外對芹菜素的研究主要集中在抗氧化、抗腫瘤等方面，隨著應用價值的增加，芹菜素的開發利用成為學者關注的重點。研究發現，芹菜素能夠影響小鼠精子運動參數［1］;也可抑制小鼠生精上皮細胞的有絲分裂［2］;此外，有研究表明芹菜素可抑制附睪中精子的透明質酸酶活性，使受精過程發生障礙［3］。本次實驗旨在研究大劑量芹菜素對大鼠睪丸氧化還原平衡及睪丸標志酶的影響并探討其作用機制，為芹菜素的合理開發利用及其安全性提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 實驗對象

SPF 級成年健康雄性SD 大鼠48 只，體重180～200 g，動物合格證號:SCXK(甘)2011-0001-0001176，購于甘肅中醫學院醫學實驗動物中心［實驗中心合格證號:SCXK(甘)2011-0001-0002756］，動物飼養于SPF 級實驗室內，恒溫、恒濕、普通飼料喂養。

1.2 主要試劑與儀器

芹菜素(AP，產品批號:HK20120405)購于陜西慧科植物開發有限公司，純度為98.11%，用生理鹽水配置成所需濃度。試劑盒:總超氧化物歧化酶(SOD，20121227)，過氧化氫酶(CAT，20130103)，谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px，20121227)，丙二醛(MDA，20130103)，總抗氧化能力(T-AOC，20121229)，超微量ATP酶(Ca2+Mg2+-ATP，20130116)，超微量Na+K+-ATP 酶(Na+K+-ATP，20130106)，一氧化氮合酶(NOS，20121227)，乳酸脫氫酶(LDH，20121225)，酸性磷酸酶(ACP，20121227)，堿性磷酸酶(AKP，20121225)，考馬斯亮蘭試劑盒(20121226)購于南京建成生物工程研究所。酶聯免疫試劑盒:山梨醇脫氫酶(SDH，20130114)，谷胱甘肽(GSH，20130114)購于上海晶天生物工程有限公司。主要儀器:安圖酶標儀(鄭州安圖生物技術有限公司，型號Anthos 2010)，722型分光光度計(上海精密科學儀器有限公司)。

1.3 實驗方法

大鼠按體重隨機分為對照組、芹菜素低、中、高劑量組，每組12 只，分別灌胃給予生理鹽水10 mL/kg·bw、等體積的芹菜素234、468、936 mg/kg·bw，每天一次，連續35 d。于末次灌胃24 h 后稱重、處死大鼠，迅速摘取睪丸、附性腺組織(SAT，包括陰莖、前列腺、精囊腺、肛提肌/球海綿體肌、尿道球腺)并稱重，-20 ℃保存。

1.4 睪丸組織勻漿的制備及指標測定

睪丸去除被膜及血管，置于玻璃勻漿器中，用0.86% NS 制成質量濃度為10%的組織勻漿，于離心機中4 ℃，3000 rpm 離心10 min，棄去沉渣，取上清液。按照試劑盒提供的說明書測定各項指標。

1.5 統計學分析

2 實驗結果

2.1 芹菜素對大鼠睪丸臟器系數、附性腺組織濕重的影響

芹菜素灌胃35 d，低、中、高劑量組睪丸臟器系數和附性腺組織(SAT，包括陰莖、前列腺、精囊腺、肛提肌/球海綿體肌、尿道球腺)濕重與對照組比較，差異均無統計學意義(P＞0.05)。如表1 所示。

表1 芹菜素對大鼠睪丸臟器系數、附性腺組織濕重的影響(n=12±s)Table 1 Effect of apigenin on organ coefficient of testis and wet weight of accessory sex organs of rats(n=12±s)

表1 芹菜素對大鼠睪丸臟器系數、附性腺組織濕重的影響(n=12±s)Table 1 Effect of apigenin on organ coefficient of testis and wet weight of accessory sex organs of rats(n=12±s)

注:與對照組比較，* P ＜0.05，＊＊ P ＜0.01。Note:Compared with control，* P ＜0.05，＊＊P ＜0.01.

2.2 芹菜素對大鼠睪丸氧化還原平衡的影響

低劑量組SOD 和中劑量組GSH-Px 酶活力與對照組比較降低，差異有統計學意義(P＜0.05)。低劑量組芹菜素降低SOD/(GSH-Px +CAT)，中、高劑量組升高SOD/(GSH-Px +CAT)，與對照組比較差異有統計學意義(P＜0.01)。見表2。

表2 芹菜素對大鼠睪丸SOD、GSH-Px、CAT 活力的影響(n=12±s)Table 2 Effect of apigenin on activities of SOD，GSH-Px and CAT in testis of rats(n=12±s)

表2 芹菜素對大鼠睪丸SOD、GSH-Px、CAT 活力的影響(n=12±s)Table 2 Effect of apigenin on activities of SOD，GSH-Px and CAT in testis of rats(n=12±s)

注:與對照組比較，* P ＜0.05，＊＊ P ＜0.01。Note:Compared with control，* P ＜0.05，＊＊P ＜0.01.

低劑量和中劑量芹菜素能夠升高T-AOC，而高劑量芹菜素則降低T-AOC 水平，與對照組比較差異有統計學意義(P＜0.05)。各劑量組GSH 活性與對照組比較均有明顯的下降，差異有統計學意義(P＜0.05)，且與芹菜素劑量呈負相關(P＜0.01)。低劑量組MDA 含量低于對照組，差異有統計學意義(P＜0.05)。如表3 示。

表3 芹菜素對大鼠睪丸T-AOC 活力和MDA、GSH 含量的影響(n=12±s)Table 3 Effect of apigenin on activity of T-AOC and content of MDA，GSH in testis of rats(n=12±s)

表3 芹菜素對大鼠睪丸T-AOC 活力和MDA、GSH 含量的影響(n=12±s)Table 3 Effect of apigenin on activity of T-AOC and content of MDA，GSH in testis of rats(n=12±s)

注:與對照組比較，* P ＜0.05，＊＊ P ＜0.01。Note:Compared with control，* P ＜0.05，＊＊P ＜0.01.

2.3 芹菜素對大鼠睪丸標志酶活性的影響

低、中、高劑量組芹菜素使ACP、AKP、LDH 活力降低，與對照組比較，差異有統計學意義(P＜0.01)。見表4。

表4 芹菜素對大鼠ACP、AKP、LDH 活力的影響(n=12±s)Table 4 Effect of apigenin on activities of ACP，AKP and LDH in testis of rats(n=12±s)

表4 芹菜素對大鼠ACP、AKP、LDH 活力的影響(n=12±s)Table 4 Effect of apigenin on activities of ACP，AKP and LDH in testis of rats(n=12±s)

注:與對照組比較，* P ＜0.05，＊＊ P ＜0.01。Note:Compared with control，* P ＜0.05，＊＊P ＜0.01.

由表5 可見，低、中、高劑量組芹菜素能升高Ca2+Mg2+-ATP，與對照組比較差異有統計學意義(P＜0.05)。高劑量組Na+K+-ATP 相比對照組升高，差異有統計學意義(P＜0.05)。各劑量組SDH、NOS 活力與對照組比較差異無統計學意義(P＞0.05)。

3 討論

本實驗條件下，234、468、936 mg/kg AP 灌胃35 d，大鼠未見明顯的不適癥狀，也未出現死亡;各劑量組芹菜素對大鼠睪丸臟器系數和附性腺組織重量無影響。提示芹菜素對大鼠睪丸和附性腺組織無明顯毒性。

正常生理狀態下，機體代謝產生的活性氧自由基在體內抗氧化酶及外源性和內源性的抗氧化劑共同作用下清除，維持對機體有利無害的動態平衡。當平衡被破壞，自由基的生成超過機體的清除能力，過量的自由基便在體內蓄積，并攻擊生物膜引發脂質過氧化反應，從而引起細胞代謝及功能障礙，對機體產生毒害作用。SOD、CAT、GSH-Px 為生物機體組織中重要的抗氧化酶。SOD 主要功能是使超氧自由基歧化生成H2O2;CAT 的生理作用是催化H2O2分解為O2和H2O，使細胞免遭H2O2的毒害;GSH-Px 主要生物學作用是清除脂質氫過氧化物，在CAT 含量少的組織，可代替CAT 清除H2O2。SOD/(GSH-Px+CAT)可用來反映機體自由基含量水平，比值升高提示機體自由基水平較高，反之則為較低［4］。T-AOC 為機體總抗氧化能力的指標，其與抗氧化酶的活性、MDA 含量三者共同反映機體脂質過氧化水平。

表5 芹菜素對大鼠睪丸SDH、Na +-K +-ATP、Ca2+-Mg2+-ATP、NOS 活力的影響(n=12±s)Table 5 Effect of apigenin on activities of SDH，Na +-K +-ATP，Ca2+-Mg2+-ATP and NOS in testis of rats(n=12±s)

表5 芹菜素對大鼠睪丸SDH、Na +-K +-ATP、Ca2+-Mg2+-ATP、NOS 活力的影響(n=12±s)Table 5 Effect of apigenin on activities of SDH，Na +-K +-ATP，Ca2+-Mg2+-ATP and NOS in testis of rats(n=12±s)

注:與對照組比較，* P ＜0.05，＊＊ P ＜0.01。Note:Compared with control，* P ＜0.05，＊＊P ＜0.01.

芹菜素有直接清除自由基，螯合過渡態金屬離子(Fe2+、Cu2+等)和抑制NO 的生成等作用，使羥自由基(·OH)合成減少，最終MDA 生成減少。本實驗條件下，AP 236 mg/kg 處理組SOD/(GSH-Px +CAT)降低，T-AOC 升高、MDA 降低，提示236 mg/kg AP 主要表現出抗氧化作用，大鼠睪丸總抗氧化能力升高，自由基或ROS 減少，此時睪丸組織內自由基水平不高，抗氧化酶表達水平較低。此外，大鼠睪丸中的GSH 含量明顯下降，可能是GSH 在過氧化物酶作用下被芹菜素協同氧化的結果［5］。

468 mg/kg AP 灌 胃35 d，SOD/(GSH-Px +CAT)、T-AOC 升高、GSH 降低。提示此劑量下，大鼠睪丸組織自由基水平升高，SOD 等抗氧化酶表達升高，外源性的抗氧化劑和抗氧化酶活性的增加導致T-AOC 升高。此時，芹菜素的抗氧化作用大于促氧化作用。936 mg/kg AP 灌胃35 d，SOD/(GSH-Px+CAT)升高，T-AOC 降低，GSH 降低。提示本劑量條件下，大鼠睪丸自由基水平升高，總抗氧化能力反而降低，GSH 消耗明顯高于AP 236、468 mg/kg 劑量組，芹菜素促氧化作用大于抗氧化作用。

ACP 主要存在于睪丸支持細胞內，主要功能是清除受損或衰老的細胞，其生成減少與生精上皮和睪丸支持細胞的變性有關［6］，是精子形成障礙的標志之一。AKP 與睪丸生精細胞的分裂密切相關，并參與生精細胞營養物質的轉運［6］。LDH 和SDH 廣泛分布在生精小管和生精細胞中，LDH 是精子能量代謝必需的酶，其活性與生精上皮成熟，各級生精細胞代謝及精子活動、獲能有關，化學性誘導應激可導致LDH 活性升高［7］。SDH 作為參與三羧酸循環的關鍵酶，同時參與組織的代謝、分泌和營養物質的吸收，其活性對于評價精子線粒體功能具有重要意義［7］。一氧化氮(NO)是體內目前已知的重要的氣態信號配體，其在睪丸組織內不僅參與睪丸微循環的調節、睪酮的分泌，而且對精子的發生、活動及受精能力均有重要作用。由于其半衰期短，一般用NOS 來評價。ATP 酶存在于細胞膜上，是物質轉運和信號傳導的載體。ATP 在睪丸線粒體的分解代謝取決于Ca2+Mg2+-ATP 酶的活性，而Ca2+Mg2+-ATP可因生精細胞的變性而升高［4］。

本次實驗結果:AP 234、468、936 mg/kg 劑量組，LDH、ACP、AKP 酶的活性均有明顯的降低，而Ca2+Mg2+-ATP 酶在AP 234、468、936 mg/kg 組升高，提示本實驗條件下，芹菜素能抑制雄性大鼠生精及精原細胞分裂過程，其機制與生精細胞變性及能量代謝異常有關。本次研究觀察到芹菜素具有抗氧化和促氧化的雙重作用，與相關報道一致［8］。芹菜素在234、468 mg/kg 劑量時，抗氧化作用占主導，與其本身具有良好的自由基清除能力有關，睪丸組織內產生的自由基一定程度上能被芹菜素和抗氧化酶系統所清除;而在936 mg/kg 劑量時，因芹菜素的氧化形式半苯醌與GSH 和NADPH 等的協同氧化作用產生過多的自由基［9］，導致維持機體自由基平衡的系統受到破壞，機體自由基水平升高，表現出促氧化作用。抗氧化酶是機體中重要的自由基清除劑，正常活性的抗氧化酶促進生殖細胞的發育與分化，活性異常則可能導致生精過程障礙［10］。結合本實驗中大鼠精子質量的觀察結果:936 mg/kg 處理組d級精子密度顯著增大，精子活力、活率降低、不動率增大，VCL、VSL、STR 降低，BCF 升高(結果可見相關文章)。提示936 mg/kg 芹菜素引起抗氧化酶、睪丸標志酶活性異常所致生精過程障礙，可降低大鼠精子質量。

綜上，在本實驗中，936 mg/kg 芹菜素在睪丸組織雖然表現出促氧化作用，但對大鼠睪丸脂質過氧化損傷不明顯，同時可降低大鼠精子質量，為芹菜素的抗生育作用的合理開發利用提供現實的指導意義。

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