海洋真菌Penicillium sclerotiorum FS50 的化學成分研究

陶美華，李樂軍，陳玉嬋，霍光華，章衛(wèi)民*

1省部共建華南應用微生物國家重點實驗室 廣東省菌種保藏與應用重點實驗室 廣東省微生物應用新技術公共實驗室廣東省微生物研究所，廣州 510070;2 江西農(nóng)業(yè)大學生物科學與工程學院，南昌 330045

海洋微生物長期生活在海洋環(huán)境中，具有應對高鹽、弱堿性、低營養(yǎng)、缺氧等惡劣環(huán)境的能力，在其生長過程中能夠產(chǎn)生有別于陸生微生物的次級代謝產(chǎn)物，其中海洋真菌因其生長速度快、易于培養(yǎng)、可通過大規(guī)模發(fā)酵實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)等優(yōu)勢受到人們的廣泛關注。海洋真菌的次生代謝產(chǎn)物結構類型多樣，主要包括聚酮類、萜類、甾體、生物堿、肽類及其它含氮化合物等［1］，其中不乏活性顯著、結構新穎的化合物［2］。海洋真菌已成為繼海洋放線菌之后的又一研究熱點。

為了從海洋真菌中尋找結構新穎的活性代謝產(chǎn)物，本課題組對分離自南海沉積物的海洋真菌進行了抗腫瘤、抗菌活性篩選，發(fā)現(xiàn)菌核青霉Penicillium sclerotiorumFS50 對腫瘤細胞MCF-7 的抑制率為97.6%，對金黃色葡萄球菌的抑制率為72.8%［3］。本研究在此基礎上對菌株FS50 的次級代謝產(chǎn)物進行深入研究，從該菌株的液體發(fā)酵產(chǎn)物中共分離得到9 個化合物，分別鑒定為penicilazaphilone B(1)、sclerotioramine(2)、紫檀醇(3)、亞油酸甘油酯(4)、(3β，5α，6β，22E)-6-methoxyergosta-7，22-diene-3，5-diol(5)、啤酒甾醇(6)、對羥基苯乙酮(7)、酪醇(8)、鄰苯二甲酸二(2-乙基)己酯(9)(圖1)。其中化合物3 為首次從青霉屬中分離得到，化合物2、4、5、6、8、9 為首次從菌核青霉中分離得到。化合物3同時存在于發(fā)酵液及菌絲體中，化合物1、7 為從發(fā)酵液中獲得，化合物2、4、5、6、8、9 為從菌絲體中獲得。

1 儀器與試劑

AVANCE III 型500 MHz 核磁共振波譜儀，Bruker 公司;PZ1000B 旋轉式大容量普通搖床，武漢瑞華儀器設備有限公司;RE-2000 型旋轉蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠;超凈工作臺，上海恒益科技有限公司;LC-20AT 型高效液相色譜儀，日本島津公司;柱層析硅膠(100～200 目、200～300 目)，青島海洋化工廠;高效薄層硅膠板Silica gel 60 F254，Merck 公司;C18反相硅膠(40～75 μm)，F(xiàn)uji Silysia Chemical Ltd.;凝膠Sephadex LH-20(18～110 μm)，Amersham Biosciences;溶劑及試劑均為分析純，購自廣州化學試劑廠。

2 菌種與發(fā)酵培養(yǎng)

菌株FS50 于2009年12月分離自南海(21°30.736'N，116°54.842'E)336 米深處的沉積物，經(jīng)鑒定為菌核青霉(Penicilliumsclerotiorum)［3］。發(fā)酵培養(yǎng)基為馬鈴薯葡萄糖(PD)液體培養(yǎng)基:馬鈴薯200 g/L，葡萄糖20 g/L，KH2PO43 g/L，MgSO41.5 g/L，海鹽15 g/L，維生素B110 mg/L，pH 自然。用接種針挑取適量活化好的菌體接種到裝有250 mL PD 液體培養(yǎng)基的500 mL 錐形瓶中，在28 ℃、130 rpm 條件下?lián)u床培養(yǎng)3 d，獲得種子液。將種子液按照5%的接種量接種到裝有250 mL PD 液體培養(yǎng)基的500 mL 錐形瓶中，培養(yǎng)條件與種子液相同，培養(yǎng)時間為7 d，共發(fā)酵100 L。

圖1 化合物1～9 的結構式Fig.1 Chemical structures of compounds 1-9

3 提取與分離

發(fā)酵產(chǎn)物經(jīng)過濾得發(fā)酵液和菌絲體，發(fā)酵液用乙酸乙酯按1∶1 比例萃取4 次，40 ℃下減壓濃縮得浸膏28 g;菌絲體置于50 ℃烘箱中烘干后粉碎，甲醇浸泡并用超聲波破碎細胞壁，共浸提4 次，收集甲醇提取液濃縮至無醇味，加適量水懸浮，再用乙酸乙酯萃取5 次，40 ℃減壓濃縮得浸膏98 g。發(fā)酵液提取物浸膏過正相硅膠柱，以石油醚/乙酸乙酯(50∶1→1∶2)及氯仿/甲醇(15∶1→1∶1)梯度洗脫，得到組分F-A～F-C。石油醚/乙酸乙酯(5∶1)洗脫得到的F-B 組分經(jīng)凝膠柱二氯甲烷/甲醇(1∶1)洗脫得到組分F-B-1，再經(jīng)半制備HPLC 甲醇/水(50∶50→70∶30)梯度洗脫，分別得到化合物7(15.5 mg)和3(2.3 mg)。氯仿/甲醇(10∶1)洗脫下來的組分F-C 用甲醇/水(70∶30)洗脫得到化合物1(17.3 mg)。菌絲體提取物浸膏過正相硅膠柱得到6 個組分J-A～JF。石油醚/乙酸乙酯(8∶1)洗脫得到組分J-A 經(jīng)凝膠柱二氯甲烷/甲醇(1∶1)洗脫得到化合物3(30.0 mg)。石油醚/乙酸乙酯(3∶1)洗脫得到組分J-B 以甲醇/水(50∶50)為洗脫劑經(jīng)C18反相柱洗脫得到組分J-B-3，再以二氯甲烷/甲醇(1∶1)為洗脫劑的凝膠柱純化得到油狀無色化合物4(11.3 mg)。石油醚/乙酸乙酯(3∶1)洗脫得到的組分J-C 以二氯甲烷/甲醇(1∶1)為洗脫劑經(jīng)凝膠柱得到組分J-C-1，組分J-C-1 再經(jīng)石油醚/乙酸乙酯(3∶1→1∶1)正相柱梯度洗脫得到組分J-C-1-1 和白色粉末狀化合物8(43.3 mg)，組分J-C-1-1 再經(jīng)甲醇/水溶液(80∶20)過C18反相柱得到油狀化合物9(35.4 mg)。石油醚/乙酸乙酯(1∶1)洗脫下來的組分J-D 以半制備HPLC 甲醇/水溶液(50∶50)洗脫得到無色晶狀化合物5(15.6 mg)。氯仿/甲醇(15∶1)洗脫得到的組分J-E 和J-F 分別經(jīng)凝膠柱二氯甲烷/甲醇(1∶1)純化得到白色粉末狀化合物6(10.0 mg)和紅色粉末狀化合物2(34.3 mg)。

4 結構鑒定

化合物1 黃色粉末狀物質ESI-MSm/z:353［M+H］+，351［M-H］-，分子式為C19H28O6;1H NMR (500 MHz，MeOD)δ:4.77 (1H，dd，J=10.7，5.4 Hz，Ha-1)，3.78 (1H，dd，J=13.5，10.7 Hz，Hb-1)，5.75 (1H，s，H-4)，5.69 (1H，d，J=2.1 Hz，H-5)，3.06 (1H，m，Ha-8)，3.39 (1H，d，J=9.6 Hz，Hb-8)，6.19 (1H，d，J=15.6 Hz，H-9)，6.67 (1H，d，J=15.6 Hz，H-10)，3.41 (1H，d，J=2.2 Hz，H-12)，1.71 (1H，m，H-13)，1.43 (1H，m，Ha-14)，1.29 (1H，m，Hb-14)，0.91 (3H，t，J=7.4 Hz，H-15)，0.87 (3H，d，J=6.8 Hz，H-16)，1.32 (3H，s，H-17)，1.38 (3H，s，H-18);13C NMR (125 MHz，MeOD)δ:69.6 (C-1)，161.8 (C-3)，104.5 (C-4)，154.1 (C-4a)，116.4 (C-5)，198.9 (C-6)，75.2 (C-7)，75.4 (C-8)，36.8 (C-8a)，122.1 (C-9)，143.1(C-10)，76.2 (C-11)，80.4 (C-12)，35.8 (C-13)，29.5 (C-14)，11.7 (C-15)，13.8 (C-16)，25.8 (C-17)，19.0 (C-18)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道基本一致［4］，故鑒定化合物1 為penicilazaphilone B。

化合物2 紅色粉末狀物質EI-MSm/z:389［M］+，分子式為C21H24ClNO4;1H NMR(500 MHz，MeOD)δ:8.16 (1H，s，H-1)，7.17 (1H，s，H-4)，6.86 (1H，d，J=15.5 Hz，H-9)，7.03 (1H，d，J=15.5 Hz，H-10)，5.73 (1H，d，J=9.7 Hz，H-12)，2.53 (1H，m，H-13)，1.46 (1H，m，Ha-14)，1.34(1H，m，Hb-14)，0.90 (3H，t，J=7.4 Hz，H-15)，1.03 (3H，d，J=6.6 Hz，H-16)，1.92 (3H，s，H-17)，1.52 (3H，s，H-18)，2.14 (3H，s，H-20);13C NMR (125 MHz，MeOD)δ:145.1 (C-1)，152.9 (C-3)，111.5 (C-4)，148.0 (C-4a)，100.7 (C-5)，184.8 (C-6)，85.8 (C-7)，194.9 (C-8)，115.7 (C-8a)，118.3 (C-9)，145.7 (C-10)，133.8 (C-11)，147.7 (C-12)，35.7 (C-13)，30.7 (C-14)，11.9 (C-15)，19.8 (C-16)，12.4 (C-17)，23.4 (C-18)，171.3 (C-19)，20.2 (C-20)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道基本一致［5］，故鑒定化合物2 為sclerotioramine。

化合物3 白色粉末狀物質ESI-MSm/z:238［M］+，261 ［M+Na］+，分子式為C15H26O2。1H NMR(500 MHz，MeOD)δ:3.78 (1H，m，H-2)，1.96(1H，t，J=11.7 Hz，H-5)，1.17 (3H，s，H-12)，1.17(3H，s，H-13)，0.71 (3H，s，H-14)，4.82 (1H，d，J=1.5 Hz，Ha-15)，4.57 (1H，d，J=1.5 Hz，Hb-15);13C NMR (125 MHz，MeOD)δ:51.2 (C-1)，68.0(C-2)，46.7 (C-3)，149.2 (C-4)，50.0 (C-5)，41.5(C-6)，49.9 (C-7)，25.3 (C-8)，22.6 (C-9)，35.5(C-10)，72.8 (C-11)，26.8 (C-12)，26.3 (C-13)，17.0 (C-14)，107.6 (C-15)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道的基本一致［6］，故鑒定化合物3 為紫檀醇。

化合物4 無色油狀物質1H NMR (500 MHz，CDCl3)δ:4.21 (1H，dd，J=4.6，11.6 Hz，Ha-1)，4.16 (1H，dd，J=6.2，11.6 Hz，Hb-1)，3.94 (1H，m，H-2)，3.70 (1H，m，Ha-3)，3.61 (1H，m，Hb-3)，2.36 (2H，t，J=7.6 Hz，H-2')，1.63 (2H，m，H-3')，5.36 (4H，m，H-9'，H-10'，H-12'，H-13')，2.78(2H，t，J=6.5 Hz，H-11')，2.06 (4H，m，H-8'，H-14')，0.90 (3H，t，J=6.9 Hz，H-18');13C NMR (125 MHz，CDCl3)δ:66.0，64.2 (C-1，C-3)，71.1 (C-2)，35.0，32.4，30.4，30.2，30.0，29.9，28.1，28.0，26.5，25.8，23.4 (C-2'，C-3'，C-4'，C-5'，C-6'，C-7'，C-8'，C-11'，C-14'，C-15'，C-16'，C-17')，131.1，130.9，128.9，128.8 (C-9'，C-10'，C-12'，C-13')，14.9 (C-18')，175.2 (C=O)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道的基本一致［7］，故鑒定化合物4 為亞油酸甘油酯。

化合物5 白色粉末狀物質EI-MSm/z:444［M］+，分子式為C29H48O3;1H NMR (500 MHz，CDCl3)δ:1.56 (4H，br m，H-1，H-11)，1.87 (4H，br m，Ha-2，H-9，H-14，H-24)，1.47 (4H，br m，Hb-2，H-15，H-25)，4.06 (1H，m，H-3)，2.14 (1H，m，Ha-4)，1.76 (2H，br m，Hb-4，Ha-16)，3.18 (1H，d，J=5.0 Hz，H-6)，5.41 (1H，m，H-7)，2.04 (2H，br m，Ha-12，H-20)，1.30 (3H，m，Hb-12，Hb-16，H-17)，0.61(3H，s，H-18)，1.01 (3H，s，H-19)，1.03 (3H，d，J=6.6 Hz，H-21)，5.17 (1H，dd，J=15.3，7.7 Hz，H-22)，5.20 (1H，dd，J=15.3，7.7 Hz，H-23)，0.84(6H，d，J=6.4 Hz，H-26，H-27)，0.93 (3H，d，J=6.8 Hz，H-28)，3.40 (3H，s，-OCH3);13C NMR (125 MHz，CDCl3)δ:33.6 (C-1)，31.8 (C-2)，68.7 (C-3)，40.5 (C-4)，77.2 (C-5)，83.3 (C-6)，115.8(C-7)，144.5 (C-8)，44.7 (C-9)，38.1 (C-10)，23.0 (C-11)，40.2 (C-12)，44.7 (C-13)，55.8 (C-14)，23.7 (C-15)，28.8 (C-16)，56.8 (C-17)，13.2(C-18)，19.2 (C-19)，41.3 (C-20)，22.0 (C-21)，136.3 (C-22)，133.0 (C-23)，43.7 (C-24)，33.9(C-25)，20.8 (C-26)，20.5 (C-27)，18.5 (C-28)，59.2 (OCH3-6)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道的一致［8］，故鑒定化合物5 為(3β，5α，6β，22E)-6-methoxyergosta-7，22-diene-3，5-diol。

化合物6 白色粉末狀物質TLC 分析顯示該化合物具有甾醇類化合物的特征斑點，與實驗室啤酒甾醇標準品進行TLC 分析，采用二氯甲烷:甲醇、石油醚:乙酸乙酯、甲醇:水3 種不同的展開體系展板，其Rf 值均一致，混合點不分離，故確定為啤酒甾醇。

化合物7 白色粉末狀物質ESI-MSm/z:135［M-H］-，137［M+H］+，分子式為C8H8O2。1H NMR(500 MHz，MeOD)δ:7.88 (2H，d，J=8.8 Hz，H-2，H-6)，6.84 (2H，d，J=8.8 Hz，H-3，H-5)，2.52(3H，s，H-8);13C NMR (125 MHz，MeOD)δ:129.6(C-1)，131.6 (C-2，C-6)，115.7 (C-3，C-5)，163.5(C-4)，199.1 (C-7)，25.7 (C-8)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道的基本一致［9］，故鑒定化合物7 為對羥基苯乙酮。

化合物8 白色粉末狀物ESI-MSm/z:137［MH］-，分子式為C8H10O2。1H NMR (500 MHz，MeOD)δ:6.72 (2H，m，H-2，H-6)，7.03 (2H，m，H-3，H-5)，2.72 (2H，t，J=7.2 Hz，H-1')，3.69 (2H，t，J=7.2 Hz，H-2');13C NMR (125 MHz，MeOD)δ:156.2 (C-1)，115.6 (C-2，C-6)，130.4 (C-3，C-5)，130.5 (C-4)，38.9 (C-1')，64.1 (C-2')。以上數(shù)據(jù)與文獻報道基本一致［10］，故鑒定化合物8 為酪醇。

化合物9 無色油狀物質ESI-MSm/z:391［M+H］+，分子式為C24H38O4。1H NMR (500 MHz，CDCl3)δ:7.71 (2H，dd，J=5.7，3.3 Hz，H-3，H-6)，7.54 (2H，dd，J=5.7，3.3 Hz，H-4，H-5)，4.23(4H，m，H-1')，1.69 (2H，m，H-2');13C NMR (125 MHz，CDCl3)δ:133.3 (C-1，C-2)，131.7 (C-3，C-6)，129.7 (C-4，C-5)，69.0 (C-1')，31.2 (C-2')，39.6 (C-3')，29.8 (C-4')，23.8 (C-5')，14.9 (C-6')，24.6 (C-7')，11.8 (C-8')，168.6 (-COO-)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道一致［11］，故鑒定化合物9 為鄰苯二甲酸二(2-乙基)己酯。

5 討論

從菌核青霉FS50 的發(fā)酵產(chǎn)物中共分離鑒定出9 個化合物。化合物3 為首次從青霉屬中分離得到，化合物2、4、5、6、8、9 為首次從菌核青霉中分離得到。化合物1 和2 為嗜氮酮類化合物，這類化合物具有廣泛的生物活性，包括抗細菌、抗真菌、抗病毒、抗氧化、細胞毒、殺線蟲和抗炎等［12］。化合物3為倍半萜類化合物，具有抗腫瘤作用，在25 μg/mL時對MCF-7、SF-268、NCI-H460、HCT-116 和AGS 腫瘤細胞株有抑制作用［13］，此外還有抗真菌，昆蟲拒食活性［14，15］。化合物5 和6 為甾醇類化合物，文獻報道化合物5 對細胞株A549、SK-OV-3、SK-MEL-2、XF498 和HCT15 具有較好的細胞毒活性［16］。

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