牡丹籽餅粕中芍藥苷類成分及其大孔吸附樹脂純化研究

秦愛霞 ，紀殊晶，毛文岳，高 哲，康小虎，賈亞楠，陳 燦，崔 同*

1河北農業大學食品科技學院，保定 071000;2菏澤堯舜牡丹生物科技有限公司，菏澤 274000

牡丹籽為毛茛科芍藥屬灌木牡丹(Paeonia sufruticosaAndr.)的種子，中國民間有用牡丹籽美白皮膚，緩解腰腿疼痛，治療口腔潰瘍等的記載［1］。研究表明牡丹籽中有很多活性成分，如芍藥苷(圖1)、芍藥內酯苷、6'-O-β-D-葡萄糖芍藥內酯苷、βgentiobiosylpaeoniflorin［1-3］等。這些芍藥苷類成分具有抗氧化、抗癌［4］、抗炎、抗過敏、抗凝血、免疫調節［5］、保護慢性動脈腦缺血［6］、改善記憶［7］、減緩輻射誘導的胸腺細胞［8］和肺細胞損傷［9］等很多作用，可用于開發新型藥物制劑。目前芍藥苷多以白芍和赤芍等為原料提取［10-12］，這種途徑受種植周期和資源所限生產成本較高。

近年來富含亞麻酸和亞油酸的牡丹籽油已被批準為新食品資源［13，14］，而且高產籽用牡丹品種已大面積推廣種植［15］，工業規模的超臨界萃取油脂加工也已經投產。而以牡丹籽粕為原料提取藥用成分芍藥苷的相關研究卻尚未見報道。

大孔樹脂吸附法具有選擇性強、吸附容量大、吸附速度快、解吸容易、成本低等優點［16］，在芍藥藥用成分提取分離中曾被采用［11，12］。本研究擬針對牡丹籽餅粕的特點，對其中芍藥苷類成分進行定性定量分析，并通過篩選樹脂、考察靜態、動態吸附與解吸性能，建立一套適宜牡丹籽粕中芍藥苷類成分提取純化的新方法，為牡丹籽天然產物資源綜合開發利用提供科學根據。

圖1 芍藥苷的分子結構Fig.1 The structure of paeoniflorin

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牡丹籽粕由山東菏澤堯舜牡丹生物科技有限公司提供;大孔吸附樹脂HPD-100、HPD-200A、HPD-600A、D-101、D101A、HPD-750、HPD-826 以及HPD-500 型，由滄州寶恩化工有限公司提供，ADS-7、ADS-17 和AB-8 型由天津南開合成科技有限公司提供;氘代二甲基亞砜、四甲基硅，北京博雅大北科技開發公司;高效液相色譜(HPLC)流動相用甲醇為色譜純;水為三蒸水;其余試劑為分析純。

1.2 儀器與設備

分析型HPLC，Agilent 1200 型(安捷倫公司，美國加州帕羅阿托市)。配用CO-3010 柱恒溫控制箱(天津美瑞泰克科技有限公司)。制備型HPLC，LC3000 型(北京創新通恒科技有限公司)，配Sino-Chrom ODS-BP C18(300 mm × 20.0 mm id，10 μm)色譜柱。LC-MS 系統，由Agilent 1200 型LC、Agilent 6310 型MS 檢測器、ESI 電離源(Agilent 公司)組成。核磁共振儀，Avance III 600 MHz 型，Bruker 公司生產。AB10X-B 恒流泵，常州飛爾林流體有限公司;玻璃中壓層析柱(10 mm × 300 mm)，上海楚定分析儀器有限公司。

1.3 對照品的制備

稱取過40 目篩的牡丹籽粕1 kg，以料液比1:10 加入70%(v/v)乙醇溶液，室溫下浸泡8 h，抽濾，殘渣按上述條件重復提取兩次，合并濾液，在55 ℃水浴下真空濃縮，得牡丹籽粕乙醇提取液備用。將濃縮液調整至8.0 mg/mL，用HPD-200A 大孔吸附樹脂純化，收集乙醇洗脫液經濃縮、過0.45 μm 濾膜后，用制備HPLC 制備純化，色譜條件:流動相為甲醇:水=40 ∶60(v/v，含0.05%甲酸)，流速:10 mL/min，檢測波長:230 nm，柱溫:室溫(25 ℃)，分別收集各色譜峰，再分別重復進樣純化，用分析型HPLC 以峰面積百分比法檢測餾分的純度均在95%以上，將收集液減壓濃縮，凍干，制得純化合物用作對照品。

1.4 對照品的LC-MS 分析

LC 分析條件:色譜柱為Hypersil BDS C18(100 mm × 2.1 mm id，3 μm);柱溫30 ℃;流動相為40%甲醇(v/v，含0.05%甲酸)，流速0.6 mL/min;二極管陣列檢測器;檢測波長230 nm;進樣量5 μL。

MS 分析條件:ESI 離子源，陰離子檢測模式，噴霧器壓力:40 psi;干燥氣體溫度:350 ℃，流速:12 L/min;離子阱質量分析器掃描范圍:m/z=50～1000。

1.5 對照品的1H NMR 分析

稱取制備的對照品各5 mg，分別用氘代二甲基亞砜溶解，以四甲基硅為基準試劑進行1H NMR 分析。

1.6 HPLC 定量方法

精密稱取對照品(見1.3)，用40%甲醇配制成2.0 mg/mL 儲備液，取儲備液適當稀釋進樣，峰面積外標法定量。色譜條件:色譜柱:Kromasil C18(200 mm × 4.6 mm id，5 μm);流動相:40%甲醇水溶液(v/v);柱溫:30 ℃;檢測波長:230 nm;流速:0.8 mL/min;進樣量:5 μL。

1.7 靜態吸附動力學曲線

準確稱取預處理［16］的樹脂2.00 g(濕重)于100 mL 具塞磨口三角瓶中，加入30 mL 樣液(按1.3所述方法制得的乙醇提取液)，室溫下以100 rpm 頻率振搖吸附，每隔30 min 取上清液，采用1.6 所述方法測定其中芍藥苷的含量，繪制樹脂的吸附量隨時間變化的曲線。

1.8 大孔樹脂純化芍藥苷的條件優化

1.8.1 動態吸附條件的優化

稱取適量經預處理的大孔吸附樹脂濕法裝柱(10 mm × 200 mm)，用去離子水平衡樹脂柱，上樣，分管收集流出液，每1/2 柱床體積(BV)為1 管，用1.6 所述方法測定芍藥苷含量。當流出液中芍藥苷濃度達上樣濃度的10%時，即認為已達到吸附泄漏點，停止上樣。通過計算吸附量考察樣品溶液濃度、上樣速度對吸附效果的影響。

1.8.2 洗脫條件的優化

采用不同濃度的乙醇溶液在恒溫振蕩器中對吸附飽和的樹脂進行解吸，并用1.6 所述方法測定溶液中芍藥苷含量計算解吸率，確定最佳洗脫液濃度并考察洗脫液用量對洗脫效果的影響。

1.9 樹脂重復使用周期的考察

按照最優的吸附和洗脫條件，取芍藥苷粗提液在同一根樹脂柱上反復進行活化、吸附、洗脫，重復操作10 次，分別測定吸附液和解吸液中芍藥苷濃度，計算吸附率和解吸率。收集洗脫液，濃縮，干燥，分別計算芍藥苷的純度，評價樹脂重復使用的吸附能力和效果。

2 結果與討論

2.1 化合物1、2、3 和4 的結構分析

采用1.3 所述的提取和純化方法，收集12、14、17 和21 min 左右的色譜餾分，精制后制得1、2、3 和4 號化合物(色譜圖見圖2)。采用1.4 方法對四種化合物進行LC-MS 分析得到化合物的紫外吸收光譜和離子質荷比數據，采用1.5 方法進行1H NMR分析得到化合物的化學位移、偶合常數等信息，結果如下:

化合物1 UV nm λmax232，274 (MeOH);(-)ESI-MSm/z687 ［M+HCOO］-，641 ［M-H］-;1H NMR (DMSO-d6，600 MHz):δ 1.82 (1H，d，J=15.0 Hz，H-3α)，2.36 (1H，dd，J=15.0，6.4 Hz，H-3β)，4.19 (1H，d，J=7.8 Hz，H-4)，2.76 (1H，m，H-5)，2.09 (1H，d，J=10.9 Hz，H-7α)，2.67(1H，t，J=9.3，9.3 Hz，H-7β)，4.62 (1H，d，J=12.0 Hz，H-8α)，4.56 (1H，s，H-8β)，1.38 (3H，s，H-10)，4.43 (1H，d，J=7.7 Hz，H-1')，3.00～3.08(1H，m，H-2'，4'，5')，3.28 (1H，t，J=8.8，8.8 Hz，H-3')，4.53 (1H，dd，J=4.4，10.5 Hz H-6'α)，3.68 (1H，dd，J=4.7，11.3 Hz，H-6'β)，8.02 (2H，d，J=7.3 Hz，H-2'')，7.56 (2H，t，J=7.7，7.7 Hz，H-3'')，7.68 (1H，t，J=7.4，7.4 Hz，H-4'')，7.56 (2H，t，J=7.7，7.7 Hz，H-5'')，8.02 (2H，d，J=7.3 Hz，H-6'')，5.10 (1H，d，J=5.2 Hz，H-1''')，3.43 (1H，m，H-2''')，3.08～3.15 (2H，m，H-3'''，4''')，3.43 (1H，m，H-5''')，5.13 (1H，d，J=4.7 Hz，H-6'''α)，4.62 (1H，s，H-6'''β)。以上數據與文獻［17］報道的結果吻合，鑒定為化合物1 為6'-O-β-D-葡萄糖芍藥內酯苷。

化合物2 UV nm λmax232，274 (MeOH);(-)ESI-MSm/z525［M+HCOO］-，479［M-H］-;1H NMR (DMSO-d6，600 MHz):δ 1.85 (1H，d，J=15.0 Hz，H-3α)，2.30 (1H，dd，J=6.6，15.1 Hz，H-3β)，4.12 (1H，t，J=5.5，5.5 Hz，H-4)，2.78(1H，m，H-5)，1.91 (1H，d，J=10.8 Hz，H-7α)，2.68 (1H，dd，J=7.9，10.7 Hz，H-7β)，4.56 (1H，d，J=7.2 Hz，H-8α)，4.64 (1H，m，H-8β)，1.34(3H，m，H-10)，4.41 (1H，t，J=7.7 Hz，H-1')，3.01～3.06 (1H，m，H-2'，3'，4'，5')，3.65 (1H，d，J=11.3 Hz，H-6'α)，3.39 (1H，s，H-6'β)，8.02(2H，d，J=7.2 Hz，H-2'')，7.55 (2H，dd，J=8.3，15.9 Hz，H-3'')，7.68 (1H，t，J=7.4，7.4 Hz，H-4'')，7.55 (2H，dd，J=8.3，15.9 Hz，H-5'')，8.02 (2H，d，J=7.2 Hz，H-6'')。以上數據與文獻［17］結果吻合，鑒定為化合物芍藥內酯苷。

化合物3 UV nm λmax232，274 (MeOH);(-)ESI-MSm/z687 ［M+HCOO］-，641 ［M-H］-;1H NMR (DMSO-d6，600 MHz):δ 1.64 (1H，d，J=12.2 Hz，H-3α)，2.07 (1H，d，J=12.2 Hz，H-3β)，2.43 (1H，d，J=6.4 Hz，H-5)，1.93 (1H，d，J=10.6 Hz，H-7α)，2.39 (1H，m，H-7β)，4.67 (1H，d，J=12.2 Hz，H-8α)，4.62 (1H，d，J=12.2 Hz，H-8β)，5.33 (1H，s，H-9)，1.28 (1H，s，H-10)，4.42(1H，d，J=7.7 Hz，H-1')，3.04 (1H，m，H-2')，3.17 (1H，m，H-3')，3.11(1H，m，H-4')，2.97 (1H，m，H-5')，3.98 (1H，d，J=10.9 Hz，H-6'α)，3.44(1H，s，H-6'β)，7.99 (2H，t，J=8.0，8.0 Hz，H-2'')，7.56 (2H，t，J=7.8，7.8 Hz，H-3'')，7.69(1H，t，J=7.4，7.4 Hz，H-4'')，7.56 (2H，t，J=7.8，7.8 Hz，H-5'')，7.99 (2H，t，J=8.0，8.0 Hz，H-6'')，4.22 (1H，d，J=7.8 Hz，H-1''')，3.04(1H，m，H-2''')，3.17 (1H，m，H-3''')，3.11 (1H，m，H-4''')，3.33 (1H，m，H-5''')，3.68 (1H，d，J=11.5 Hz，H-6'''α)，3.48 (1H，d，J=7.7，11.6 Hz，H-6'''β)。與文獻［18］吻合，鑒定該化合物為β-gentiobiosylpaeoniflorin。

化合物4 UV nm λmax231，274 (MeOH);(-)ESI-MSm/z525 ［M+HCOO］-，479 ［M-H］-;1H NMR (DMSO-d6，600 MHz):δ 1.82 (1H，d，J=10.7 Hz，H-3α)，2.06(1H，t，J=10.4，10.7 Hz，H-3β)，2.44 (1H，t，J=10.1，10.1 Hz，H-5)，1.65(1H，d，J=12.1 Hz，H-7α)，2.38 (1H，dd，J=6.8，10.6 Hz，H-7β)，4.65 (2H，m，H-8)，5.35 (1H，d，J=23.6 Hz，H-9)，1.24 (3H，m，H-10)，4.39(1H，d，J=7.7 Hz，H-1')，2.93～3.15 (1H，m，H-2'，3'，4'，5')，3.39 (1H，d，J=6.2 Hz，H-6'α)，3.65 (1H，d，J=10.8 Hz，H-6'β)，7.99 (2H，t，J=7.8，7.8 Hz，H-2'')，7.55 (2H，dd，J=8.6，16.3 Hz，H-3'')，7.69 (1H，t，J=7.4，7.4 Hz，H-4'')，7.55 (2H，dd，J=8.6，16.3 Hz，H-5'')，7.99 (2H，t，J=7.8，7.8 Hz，H-6'')。1H NMR 數據與文獻［19］報道的芍藥苷數據吻合，鑒定該化合物結構為芍藥苷。

圖2 純化的6'-O-β-D-葡萄糖芍藥內酯苷(1)、芍藥苷內酯(2)、β-gentiobiosylpaeoniflorin(3)及芍藥苷(4)的HPLC 色譜圖Fig.2 HPLC chromatograms of purified 6'-O-β-D-glucopyranosylalbiflorin (1)，albiflorin (2)，β-gentiobiosylpaeoniflorin (3)and paeoniflorin (4)

2.2 牡丹籽粕粗提液成分分析

按1.3 所述方法對牡丹籽粕進行乙醇提取，得到濃縮液480 mL。用1.6 所述方法對提取液成分進行HPLC 分析，結果如圖3 所示，1～4 號色譜峰分別為6'-O-β-D-葡萄糖芍藥內酯苷、芍藥內酯苷、β-gentiobiosylpaeoniflorin 和芍藥苷，以芍藥苷含量最高，占提取物干重的8.36%(按1.6 方法計算)，其余3 種成分含量分別為3.43%、3.92%和2.50%。因此本文試驗以芍藥苷為評價指標，采用樹脂吸附法對牡丹籽粕粗提物進行純化。

圖3 牡丹籽餅粕醇提取物的HPLC 色譜圖Fig.3 HPLC chromatogram of crude extract of seed cakes of P.sufruticosa

2.3 樹脂的篩選

樹脂的極性和空間結構是影響其吸附特性的重要因素［20］。本試驗考察了極性、中極性、弱極性的11 種大孔吸附樹脂對芍藥苷的靜態吸附與解吸性能，結果見表1。由表1 可以看出，隨著樹脂極性的逐漸增強，其對芍藥苷的吸附能力會很有規律的逐漸下降，其中非極性的HPD-200A 對芍藥苷的靜態吸附量最高，氫鍵型的ADS-17 最低。95%乙醇對各樹脂的解吸能力差別較大且沒有明顯規律，其中HPD-200A 和HPD-750 的解吸率較高達到90%以上，而AB-8 和ADS-17 兩種樹脂的解吸率較低，不足30%。綜合吸附量和解吸率的結果，選用HPD-200A 樹脂用于芍藥苷純化的后續試驗。

表1 各種樹脂的類型、吸附量及解吸率Table 1 Type，adsorption capacity and desorption rate of the 11 investigated resins

2.4 靜態吸附動力學曲線

以吸附時間為橫坐標，吸附量為縱坐標作圖，得到HPD-200A 大孔吸附樹脂對芍藥苷的靜態吸附動力學曲線，如圖4 所示。由圖4 可見，HPD-200A 大孔吸附樹脂可快速吸附芍藥苷，30 min 內變化迅速，1 h 達到吸附平衡。

圖4 HPD-200A 樹脂對芍藥苷的靜態吸附動力學曲線ig.4 The kinetic curve of static adsorption of HPD-200A resin

2.5 大孔樹脂純化條件的優化

2.5.1 上樣濃度對吸附效果的影響

分別以濃度為4.0、6.2、7.4、8.5 和9.6 mg/mL的芍藥苷粗提液以1/16 BV/min 的流速上樣進行動態吸附，每1/2 BV 收集一管，測定其中芍藥苷的濃度，考察上樣濃度對吸附效果的影響。以收集管數為橫坐標、流出液中芍藥苷濃度與上樣液中芍藥苷濃度之比為縱坐標，繪制吸附透過曲線，結果見圖5。

圖5 不同濃度的芍藥苷樣液在HPD-200A 樹脂柱上的吸附透過曲線Fig.5 The adsorption breakthrough curve of different concentrations of paeoniflorin solutions on HPD-200A resin column

由圖5 可知，隨著上樣濃度的增加，穿透點逐漸提前，在濃度高于8.5 mg/mL 時，流出液中芍藥苷濃度隨上樣量的增大快速增加，而濃度低于6.2 mg/mL 時，流出液中芍藥苷濃度增加緩慢。上樣濃度過低，樹脂出現泄漏點緩慢，達到吸附飽和時所需時間較長;濃度過高，樹脂的泄漏點出現較早，樹脂未能充分吸附，使其利用率降低。因此，綜合以上因素本試驗選擇8.0 mg/mL 作為上樣液的濃度，上樣體積為4.5 倍柱體積。

2.5.2 流速對吸附效果的影響

將濃度為8.0 mg/mL 的提取液分別以0.5、1、1.5、2、2.5 mL/min 流速進行動態吸附，比較不同流速對吸附效果的影響，繪制吸附透過曲線，結果見圖6。由圖6 可知，隨著流速增加泄漏點的出現會逐漸提前，經計算其樹脂的吸附量會逐漸減少，這是因為流速過大時上樣液中的芍藥苷未能被樹脂充分吸附，造成吸附效率降低。較小的流速雖然有利于芍藥苷的充分吸附，但操作時間會相應延長，生產效率低。綜合考慮工作效率和吸附效果，我們推薦采用1 mL/min 的上樣速度較為適合，大約相當于1/16 BV/min。

圖6 不同上樣流速下芍藥苷在HPD-200A 樹脂柱上的吸附透過曲線Fig.6 The adsorption breakthrough curve of paeoniflorin solutions with different flow rates on HPD-200A resin column

2.6 大孔吸附樹脂洗脫條件的優化

2.6.1 乙醇濃度對洗脫效果的影響

向吸附平衡的樹脂中分別加入濃度為30%、40%、50%、60%、70%、80%、95% 的乙醇溶液30 mL，按1.9 所述方法充分解吸，測定洗脫液中芍藥苷的含量，比較不同濃度乙醇溶液的解吸效果。結果如圖7。由圖中可見，當乙醇濃度在40%以下時解吸不夠完全，50%～70%的乙醇可以達到很高的解吸率，繼續提高乙醇濃度解吸率不再提高。考慮生產成本和安全性的因素，最終選用50%的乙醇溶液為洗脫液。

圖7 乙醇濃度對洗脫效果的影響Fig.7 The effect of ethanol concentration on desorption

2.6.2 洗脫液用量的確定

按2.3 確定的最優吸附條件上樣，吸附之后用2 BV 去離子水淋洗樹脂柱以除去水溶性雜質。再用50%乙醇溶液以流速1.0 mL/min 進行洗脫。收集洗脫液(每1/2 BV 為1 管)，測定含量并繪制解吸曲線，如圖8 所示。由圖8 可見，當洗脫體積為2～3 BV 時，洗脫液中的芍藥苷含量達到最大值，并且洗脫峰相對集中、無明顯拖尾現象，約4 倍柱體積洗脫液可將芍藥苷基本洗脫完全，解吸率為93.0%。

圖8 芍藥苷動態洗脫曲線Fig.8 The dynamic elution curve of paeoniflorin

2.7 樹脂重復使用周期的考察

HPD-200A 樹脂的重復使用結果如表2 所示。由表中可以看出，吸附率和解吸率首次最高，分別為84.9%和94.3%，之后漸漸下降，到第四次后基本保持穩定，而芍藥苷的純度無明顯下降。說明樹脂柱對芍藥苷的死吸附很少，樹脂可重復使用多次而不需要再生。重復吸附解吸10 次，收集液的干物質中芍藥苷的平均含量為32.3%，同時6'-O-β-D-葡萄糖芍藥內酯苷，芍藥內酯苷和β-gentiobiosylpaeoniflorin 的平均含量分別為8.02%、16.5%和6.63%。

表2 HPD-200A 樹脂柱重復使用的性能變化Table 2 Changes of adsorption properties of HPD-200A resin with repeated usage

3 結論

采用制備HPLC 等方法從牡丹籽粕醇提物中分離純化了4 種主要成分，經UV、MS、NMR 分析鑒定其分別為6'-O-β-D-葡萄糖芍藥內酯苷，芍藥內酯苷，β-gentiobiosylpaeoniflorin 和芍藥苷，其中以芍藥苷含量最高。通過靜態吸附、解吸試驗從11 種備選樹脂中篩選出HPD-200A 型大孔吸附樹脂，其對牡丹籽中芍藥苷的較佳純化工藝參數為:樣液濃度8.0 mg/mL，上樣速度1/16 BV/min，上樣體積4.5 BV，洗脫液乙醇濃度50%，洗脫流速1/16 BV/min，洗脫體積4 BV。在此條件下樹脂重復使用10 次其吸附率、解吸率以及所得產品純度無明顯下降。經樹脂分離純化的提取物中含有芍藥苷32.3%，芍藥內酯苷16.5%，6'-O-β-D-葡萄糖芍藥內酯苷8.02%，β-gentiobiosylpaeoniflorin 6.63%。

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