吸附柱層析法制備純化茶多酚中EGCG 單體

王偉濤，馬朝陽，陳尚衛，朱 松，婁在祥，王洪新，*

1 江南大學食品學院;2食品科學與技術國家重點實驗室，無錫 214122

表沒食子兒茶素沒食子酸酯［(-)-Epigallocatechin Gallate，EGCG］是兒茶素類的主要成分，具有良好的功能特性，如防突變、抗癌、抗病毒、抗氧化、抑制生物膜、神經保護、調節代謝、消炎、抑菌等［1］。EGCG 已被應用于食品、化妝品、醫藥、精細化學品、保健品等各個領域。因此，尋找一條適合大規模生產、環境友好型的制備EGCG 單體工藝顯得十分必要。目前，制備純化EGCG 單體的途徑主要有色譜柱層析技術，如高速逆流色譜、制備液相色譜、硅膠柱色譜、離子交換或凝膠色譜、模擬移動床色譜以及膜分離技術等［2-5］。這些技術在能得到高純度EGCG 同時，也存在一定不足，填料成本高且使用次數有限，設備成本高昂，洗脫系統多采用三氯甲烷、乙酸乙酯等溶劑，存在殘留等安全問題等。而吸附柱色譜［3，6-8］相比其他方法，具有重復利用次數多，生產成本低，溶劑系統環保安全等優點越來越受到研究者們的關注。

本研究采用吸附樹脂柱層析進行EGCG 單體分離純化，通過考察所選樹脂對兒茶素的吸附分離情況，選擇合適的分離填料進行EGCG 單體純化。旨在開發一種綠色、環保，溶劑系統安全，適于工業化生產的生產工藝。

1 儀器與材料

茶多酚原料(批號TP081001-1032，四川宜賓)。EGCG、ECG、EGC、C、CA 標準品(成都曼思特生物科技有限公司，批號分別為A0159、A0160、A0161、A0158，A0470)，EC 標準品(中國藥品生物制品檢定所，110878-200102)，純度經檢測均大于98%。

吸附樹脂LX-68、LX-5B、LX-8、LX-2000、XDA-1(西安藍曉科技新材料股份有限公司)，ADS-5c、ADS-21(天津南開和成科技有限公司)，PA(國藥集團化學試劑有限公司)，HP-20(日本三菱化學)，AB-8、ADS-7、ADS-17、HPD-826(滄州寶恩吸附材料科技有限公司)，各樹脂特性參數見表1。

BT100-2J 蠕動泵(保定蘭格恒流泵有限公司)，SHB-3 型循環水多用真空泵(鄭州杜甫儀器廠)，BC-R202B 旋轉蒸發器(上海貝凱生物化工有限公司)，DZF-6050 真空干燥箱(上海一恒科學儀器有限公司)，Waters 1525 高效液相色譜儀及配套設備(Waters Co.Ltd.USA)，乙腈(色譜純，江蘇漢邦科技有限公司)，甲醇(色譜純，江蘇漢邦科技有限公司)，冰乙酸(國藥集團化學試劑有限公司)，95%乙醇(國藥集團化學試劑有限公司)，超純水純化系統(Millipore，USA)。

表1 樹脂特性參數Table 1 Characteristic parameters of resin used

2 提取與分離

2.1 茶多酚、兒茶素含量的測定

茶多酚含量測定參照行業標準QB 2154-1995。

兒茶素含量測定:Waters 1525 高效液相色譜儀，色譜柱:Grace Smart RP 色譜柱(C18填料，5 μm，4.6 ×250 mm);檢測器:Waters 2489 UV/visible detector;流動相:A:10%乙腈+0.5%乙酸，B:30%乙腈+0.5%乙酸，梯度洗脫程序:0～14 min:100%～50%A，14～20 min:50%～100% A，20～25 min:100%～100% A;流速:1.0 mL/min;檢測溫度:30℃;檢測波長:280 nm;進樣量:5 μL。

2.2 吸附樹脂的篩選

取預處理的樹脂(干重當量1.0 g)加到20 mL原料液(20 mg/mL)中，303.15 K 下于恒溫水浴搖床振蕩(120 rpm)12 h 至吸附平衡。過濾吸附后樹脂，80%乙醇解吸，恒溫水浴搖床振蕩(120 rpm)12 h 至解吸平衡，考察樹脂對各兒茶素的吸附容量、吸附率、解吸率和吸附選擇因數。

樹脂對EGCG 吸附容量的計算采用:

其中qe為吸附平衡時對兒茶素的吸附容量(mg/g 干樹脂)，C0、Ce分別是兒茶素起始和平衡狀態濃度(mg/mL)，V0、V1分別是原料液體積以及吸附后的溶液體積(mL)，W 是樹脂干重當量(g)。

根據下式計算樹脂對兒茶素的吸附率、解吸率及吸附選擇因數:

其中，C1為解吸液中目標物濃度(mg/mL)，V2為解吸液體積(mL)，qe為目標物吸附容量(mg/g 干樹脂)，W為樹脂干重當量(g)，RA和RB分別為EGCG 和其他兒茶素在各樹脂上的吸附容量(mg/g)，CA和CB分別為EGCG 和其他兒茶素吸附平衡濃度(mg/mL)。

2.3 LX-8 樹脂柱層析初步純化

2.3.1 上樣濃度的確定

室溫下，茶多酚原料(200、250、300、350 mg/mL)上LX-8 柱(Φ30 mm × 500 mm，柱體積245 mL)，流速1.5 BV/h。分部收集，檢測其中各兒茶素濃度，計算保留在柱子上的EGCG 量，確定上樣濃度。

2.3.2 動態吸附量的測定

室溫下，茶多酚原料(300 mg/mL)上LX-8 柱，流速分別為0.5 BV/h、1.0 BV/h、1.5 BV/h、2.0 BV/h。分部收集流出液，檢測各兒茶素濃度，以EGCG 濃度對流出液體積作動態吸附曲線圖，確定上樣流速及動態上樣量。

2.3.3 洗脫梯度及體積的確定

取茶多酚溶液，1.5 BV/h 的流速上LX-8 柱，水洗后采用5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%的乙醇溶液各600 mL(2.5 BV)以1.5 BV/h 的流速洗脫，將各組分洗脫液濃縮干燥后測定其中各兒茶素含量，計算各部收率。以各兒茶素含量對乙醇濃度作洗脫梯度曲線，從而確定洗脫梯度及體積。

2.3.4 產品制備

根據確定的洗脫梯度，取一定體積的茶多酚溶液，上LX-8 柱(Φ40 mm ×600 mm，Φ30 mm ×500 mm)，吸附完畢后，梯度洗脫。水洗后，采用不同濃度乙醇洗脫液分別進行濃縮、真空干燥得到相應產品，取不同成分樣品HPLC 分析其中兒茶素的濃度。分別計算其得率、回收率。

2.4 HP-20 樹脂二次純化

2.4.1 上樣濃度的確定

取一定量HP-20 樹脂(干重當量5.0 g)于錐形瓶中，加入不同濃度(C0=10.0、15.0、20.0、25.0和30.0 mg/mL)的LX-8 柱25%組分(200 mL)，恒溫(298.15 K)水浴振蕩4 h，分析吸附后溶液中的各兒茶素含量，計算吸附量，確定上樣濃度。

2.4.2 動態吸附量的測定

室溫下，以LX-8 柱25%乙醇洗脫組分上HP-20柱(Φ30 mm×500 mm，柱體積為210 mL)，流速分別為0.5、1.0、1.5、2.0 BV/h。分部收集流出液，檢測其中各兒茶素濃度，以EGCG 濃度對流出液體積作HP-20 樹脂動態吸附曲線圖，確定上樣流速及動態上樣量。

2.4.3 洗脫梯度及體積的確定

取LX-8 柱25%組分，1.5 BV/h 的流速上HP-20 柱，待吸附完畢后依次采用5%、10%、15%、20%、40%的乙醇溶液550 mL(2.5 BV)以1.5 BV/h 的流速洗脫，將各組分洗脫液濃縮干燥后測定其中各兒茶素的含量，計算各部收率，從而確定洗脫梯度及體積。

2.4.4 產品制備

根據確定的洗脫梯度，以LX-8 柱40%組分上HP-20 柱，進行梯度洗脫。將不同濃度乙醇洗脫液分別濃縮、真空干燥得到相應產品，分析其中兒茶素的濃度。分別計算其得率、回收率。

3 結果與討論

3.1 吸附樹脂的篩選

合適的分離填料應能選擇性吸附某一種或幾種兒茶素單體，以實現不同單體之間的分離。圖2 為不同樹脂對幾種兒茶素單體的吸附容量、吸附率及解吸率。LX-68、LX-5B、LX-8、XDA-1、ADS-21 和PA對兒茶素的吸附容量均高于其他幾種，但LX-68、LX-5B、XDA-1 和ADS-21 等對兒茶素的吸附率差別不大，且各兒茶素單體在ADS-21 樹脂上的解吸率僅為35%～55%;因此，以上四種樹脂是不適合用來選擇分離兒茶素單體的。而PA 和LX-8 對酯化和非酯化形式的兒茶素均具區分效果，以LX-8 較好，且較PA 的吸附量高。LX-2000、ADS-5c、HP-20、AB-8、HPD-826、ADS-7、ADS-17 等對酯化形式兒茶素中的EGCG 和ECG 具較好的選擇吸附效應。因此可先由LX-8 進行兒茶素初步純化，再采用LX-2000、ADS-5c、HP-20、AB-8、HPD-826、ADS-7、ADS-17 中的一種或幾種進行二次純化。

圖2 不同樹脂對各兒茶素的吸附容量、吸附率及解吸率Fig.2 Adsorption capacity，adsorption ratio and desorption ratio of catechins on different resins

EGCG 對其他兒茶素單體的選擇吸附因數在選用的幾種樹脂上有一定的區別(表2)。其中，ADS-7、AB-8、HP-20 等具較好的選擇性，以HP-20 稍高。因此，我們選擇LX-8 和HP-20 進行后續實驗。

表2 EGCG 對其他幾種兒茶素單體的選擇吸附因數Table 2 Selectivity coefficient of EGCG towards other catechin monomers

3.2 LX-8 樹脂柱層析初步純化

3.2.1 上樣濃度的確定

隨上樣濃度增大，單位體積樹脂柱上保留的EGCG 量呈現先增加后趨于平穩(圖3)。上樣濃度為300.025 mg/mL，樹脂柱上的EGCG 保留量達到81.889 mg/mL;繼續增大上樣濃度，保留量未見明顯增加。因此，選擇上樣濃度為300 mg/mL。

圖3 不同上樣濃度下EGCG 在LX-8 樹脂柱上的保留量Fig.3 Adsorption amount of EGCG on LX-8 resin column with different sample concentration

3.2.2 動態吸附量的測定

不同上樣流速下得到的吸附泄漏曲線如圖4，上樣流速為0.5、1.0、1.5 BV/h 時得到的泄漏點上樣體積分別為90、60、50 mL，而2.0 BV/h 時得到的為15 mL。上樣流速決定著泄漏點上樣體積的大小，較小的流速可增加上樣體積，但會增加操作時間，太快易導致過早泄漏;因此，選擇上樣流速為1.5 BV/h，上樣體積為50 mL。

3.2.3 洗脫梯度及體積的確定

圖4 EGCG 在LX-8 樹脂柱上的吸附泄漏曲線Fig.4 Adsorption permeation curve of EGCG on LX-8 resin column

不同濃度乙醇梯度洗脫后各組分中兒茶素含量見圖5。經5%、10%、15%乙醇梯度洗脫可將非酯化形式兒茶素完全解吸，之后酯化形式兒茶素開始解吸。25% 的乙醇組分中EGCG 含量最高，為65.85%，得率為15.23%。因此，采用洗脫梯度:10%乙醇洗脫6 BV，25%乙醇洗脫6 BV，80%乙醇洗脫4 BV。

圖5 不同濃度乙醇梯度洗脫組分中各兒茶素含量Fig.5 Catechins content of ethanol solution step-gradient elution

3.2.4 產品制備

按洗脫梯度進行梯度洗脫，得到不同濃度乙醇組分產品，其中各兒茶素含量、得率及收率見表3。

表3 不同濃度乙醇梯度洗脫制備產品Table 3 Fraction of ethanol solution step-gradient elution

吸附后的LX-8 柱經水洗除去未吸附組分后，10%乙醇洗脫6 BV 可將吸附的非酯化形式的兒茶素解吸下來，25%的乙醇洗脫組分中EGCG 的收率為61.21%。初步實現了非酯化形式和酯化形式兒茶素的分離。但25%乙醇洗脫組分中仍存在部分色素，會影響下一步產品純化，因此考慮將制得的25%洗脫組分再次經LX-8 柱層析，以進一步提高其中的EGCG 純度。采用40%乙醇洗脫5 BV 可將柱子上吸附的絕大部分EGCG 解吸下來，產品中EGCG 純度得到了提高。

3.3 HP-20 樹脂二次純化

3.3.1 上樣濃度的確定

靜態吸附結果如圖6 所示，隨上樣濃度增加，HP-20 對EGCG 的吸附量呈現增加趨勢，濃度為20 mg/mL 時達到飽和吸附，吸附量不再增加。因此，確定上樣濃度為20 mg/mL。

圖6 EGCG 在LSA-10 樹脂上的吸附等溫線Fig.6 Static isotherm adsorption curves of EGCG on LSA-10

圖7 EGCG 在HP-20 樹脂柱上的吸附泄漏曲線Fig.7 Adsorption permeation curve of EGCG on HP-20 resin column

3.3.2 動態吸附量的確定

EGCG 在HP-20 樹脂柱上的吸附泄漏曲線如圖7 所示。上樣流速為0.5、1.0、1.5 BV/h 時得到的泄漏點上樣體積為400、350、300 mL，而2.0 BV/h時為200 mL。因此，選擇流速1.5 BV/h，上樣300 mL，即1.5 BV。

3.3.3 洗脫梯度及體積的確定

不同濃度乙醇洗脫組分中兒茶素含量如圖8。15%乙醇組分中EGCG 含量最高，為85.70%，收率為35.65%，5%洗脫組分呈現深紅色，EGCG 含量僅為69.73%。根據各組分中EGCG 收率，確定洗脫梯度為5%洗脫3 BV 以除去色素，15%洗脫6 BV將吸附的EGCG 解吸下來，采用80%洗脫3 BV 清洗柱子。

圖8 不同濃度乙醇洗脫組分中兒茶素含量Fig.8 Catechins content of ethanol solution step-gradient elution

3.3.4 產品制備

按洗脫梯度及體積對HP-20 樹脂柱洗脫，得到的各組分中兒茶素含量、得率及收率如表4 所示。

表4 不同濃度乙醇梯度洗脫制備產品Table 4 Fraction of ethanol solution step-gradient elution

5%乙醇洗脫3 BV 可將吸附的色素類成分解吸下來，15%的乙醇洗脫可將大部分EGCG 解吸下來，實現了EGCG 和ECG 的分離。

經過LX-8 樹脂和HP-20 樹脂柱層析后，由EGCG 含量50%的茶多酚原料可得到EGCG 純度為93.16%的產品，且總收率為49.50%。相比文獻［8］報道中的總收率(72.08%)略低，但文獻報道中制得EGCG 產品純度僅為68.32%，遠低于本研究制得的EGCG 產品純度。LX-8 柱層析時，柱體積為600 mL 的柱子裝填LX-8(含水率70.74%)為336 g，上樣茶多酚(EGCG 含量50%)原料27.5 g，單位體積樹脂EGCG 負載量為139.86 mg/g 樹脂干重當量。

HP-20 柱層析時，柱體積為245 mL 的柱子裝填HP-20(含水率71.37%)為173 g，上樣二次LX-8 柱層析后40%組分4.5 g，單位體積樹脂EGCG 上樣量為66.32 mg/g 樹脂干重當量。

該工藝單位重量填料的EGCG 負載量高于文獻中報道的負載量(20～50 mg/g)，且洗脫溶劑僅為乙醇/水，溶劑系統安全、無殘留且可實現循環利用，其使用成本較甲醇、乙酸乙酯、氯仿等溶劑低。該工藝是一種環境友好型工藝，有良好的應用前景。

3.4 結構表征

微紅色粉末;熔點212～213 ℃;易溶于甲醇;分子式C22H18O11;ESI-MSm/z:457［M-H］-，169;紅外光譜在1693 cm-1處強吸收為羰基伸縮振動峰;1H NMR (CD3OD，500 MHz)δ:4.95 (1H，s，H-2)，5.52(1H，s，H-3)，2.85 (2H，m，H-4a，H-4b)，5.99 (2H，s，H-6，H-8)，6.41 (2H，s，H-2'，H-6')，6.83 (2H，s，H-3''，7'');13C NMR (CD3OD，125 MHz)δ:78.8(C-2)，70.2 (C-3)，27.0 (C-4)，99.7 (C-6)，96.8(C-8)，96.2 (C-10)，157.4 (C-5，C-9)，157.9 (C-7)，131.1 (C-1')，107.2 (C-2'，C-6')，146.9 (C-3'，C-5')，134.0 (C-4')，167.9 (C-1'')，121.8 (C-2'')，110.5 (C-3''，C-7'')，146.5 (C-4''，C-6'')，140.0 (C-5'')。與文獻［2］對照產品鑒定為表沒食子兒茶素-3-沒食子酸酯(EGCG)。

4 結論

本研究以茶多酚(EGCG 含量50%)為原料，根據兒茶素單體的結構特征，選用極性和低(非)極性樹脂進行選擇性吸附分離?？疾鞓渲瑢翰杷氐奈饺萘?、吸附率、解析率及吸附選擇因數，選擇LX-8樹脂初步純化后采用HP-20 樹脂二次純化。經LX-8 兩步柱層析，1.5 BV/h 流速洗脫，40%乙醇洗脫5 BV 可得到純度為73.06% 的EGCG 產品。以20 mg/mL 濃度的該產品上HP-20 柱，1.5 BV/h 洗脫，經5%乙醇洗3 BV，15%乙醇洗6 BV，80%乙醇洗3 BV 后，可制得純度為93.16%，總收率為49.50%的EGCG 產品。該工藝單位重量填料的EGCG 負載量高于文獻中報道的負載量，僅采用乙醇/水洗脫溶劑體系，溶劑系統安全、無殘留且可實現循環利用，其使用成本較甲醇、乙酸乙酯、氯仿等溶劑低。有良好的應用前景，屬于環境友好型工藝。

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