加味葦莖湯及其成分芹菜素對肺腺癌A549 細胞增殖、周期與凋亡的影響

辛麗麗，姜 淼，許冬青，張 旭，陳 惠，龔婕寧

南京中醫(yī)藥大學，南京 210046

原發(fā)性支氣管肺癌為最常見的惡性腫瘤，具有高發(fā)病率、高致死率的特點。非小細胞肺癌約占肺癌總數(shù)的80%，其中約1/2 為肺腺癌。肺腺癌易侵襲、易轉移、易耐藥，嚴重威脅著患者的健康。中醫(yī)藥通過多途徑、多環(huán)節(jié)和多靶點治療方式在肺癌綜合治療模式中的作用引起越來越廣泛的關注，抗癌中藥復方的開發(fā)及中藥有效抗癌成分的提取已成為中醫(yī)藥治療肺癌的重要途徑。加味葦莖湯是南京中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院多年臨床治療肺癌的驗方，尤其在肺癌早期，以清熱活血為原則，合理應用該方可以有效改善患者的臨床癥狀，提高生存質量［1］。本研究選擇加味葦莖湯及相關成分芹菜素為研究藥物，觀察其對肺腺癌A549 細胞增殖、細胞周期及凋亡的影響，從而探討該方藥治療肺癌的主要作用機制。

1 材料與儀器

1.1 動物與細胞株

健康新西蘭兔10 只，雌雄不限，體重2.5～3.0 kg，由南京中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供，合格證號SCXK(蘇)2007-0008;肺癌細胞A549，購自中國科學院上海研究院。

1.2 藥物

加味葦莖湯:蘆根、冬瓜子、苡仁、桃仁、虎杖、半枝蓮，各藥量比例為:10∶8∶10∶3∶10∶10，藥材購自南京中醫(yī)藥大學國醫(yī)堂門診部，經(jīng)中藥專家鑒定屬正品。常規(guī)煎煮濃縮為100%中藥合劑，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｇ鄄怂?購自中檢所)。

1.3 試劑與儀器

1640 培養(yǎng)液(Gibco，1171219);胎牛血清(Gibco，10099-141);胰蛋白酶(solarbio，T8150);MTT(solarbio，705B059);二甲亞砜(DMSO)(aladdin，B1328005);多聚甲醛(永華，040829);hoechst33342染料(solarbio，B8040)。

光學顯微鏡(OLYMPUS，8A12661);自動酶標分析儀(ETL，182473);流式細胞儀(ETL，E2901);熒光顯微鏡(OLYMPUS，3H06225)。

2 實驗方法

2.1 含藥血清制備

健康新西蘭兔隨機分為含藥血清組和對照血清組。含藥血清組以人等效劑量的8 倍量中藥灌胃，給藥劑量為57.12 g/kg·d，每天分2 次給藥，連續(xù)給藥3 d，第3 d 灌胃1 次，給足1 天劑量。末次灌胃前禁食12 h，給藥后1 h 在家兔清醒狀態(tài)下(局麻)從頸動脈采血，常規(guī)分離血清，56 ℃水浴30 min滅活補體，用0.22 μm 醋酸纖維素膜過濾除菌，-20℃保存?zhèn)溆谩φ昭褰M以生理鹽水灌胃，同法采血制備血清。

2.2 細胞培養(yǎng)

肺腺癌細胞A549 用含10% 胎牛血清的RPMI1640 培養(yǎng)液，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對數(shù)生長期的細胞，調整濃度為1 ×105個/mL，分別用各種濃度的含藥血清及芹菜素處理細胞，未加藥組(只加單培)為空白對照組。RPMI1640 培養(yǎng)液稀釋含藥血清，含藥血清濃度梯度為10%、5%、2.5%、0%(空白血清組)，空白血清補齊，使終末血清濃度均為10%。芹菜素溶解于DMSO 5‰，初濃度為10 mmoL/L，用RPMI1640 培養(yǎng)液稀釋成50 μmoL/L，倍比稀釋法稀釋，并保證每組DMSO 濃度為5‰。

2.3 分組方法

加味葦莖湯含藥血清分組設置:10%含藥血清組、5%含藥血清組、2.5%含藥血清組、空白血清組、空白對照組(單培組)。

芹菜素實驗分組設置:50、25、12.5、6.25 μmoL/L 芹菜素樣品組、空白對照組(單培組)、DMSO5‰組。

2.4 指標檢測

2.4.1 細胞形態(tài)學變化

每孔100 μL 單細胞懸液接種于96 孔板上，培養(yǎng)過夜，于倒置顯微鏡下觀察不同濃度含藥血清及芹菜素作用后24、48 h 時細胞形態(tài)變化。

2.4.2 細胞生長抑制率

每孔100 μL 單細胞懸液接種于96 孔板上，細胞貼壁后分組給藥，每組8 個復孔，按上述培養(yǎng)方法分別培養(yǎng)24、48 h。并于24、48 h 提前4 h 每孔加入MTT 20 μL(10 mg/mL)，繼續(xù)培養(yǎng)至4 h 后棄培養(yǎng)液終止培養(yǎng)，每孔加入150 μL DMSO 溶解液，低速振蕩15 min，空白孔調零，使用酶標儀在490 nm 波長處檢測OD 值，計算細胞生長抑制率。

細胞生長抑制率=(1-實驗組OD 值/空白對照組OD 值) ×100%

2.4.3 細胞周期

每孔1500 μL 單細胞懸液接種于6 孔培養(yǎng)板中，細胞貼壁后分組給藥，每組3 個復孔，按上述培養(yǎng)方法分別培養(yǎng)24、48 h。消化收集細胞，調整濃度為5 ×105個，加入BindingBuffer 懸浮細胞500 μL后，加入PI 2 μL 混勻，避光、室溫反應20 min，流式細胞儀檢測。

2.4.4 細胞凋亡

每孔1500 μL 單細胞懸液接種于鋪有處理過的蓋玻片的6 孔培養(yǎng)板中，細胞貼壁后分組給藥，每組3 個復孔，按上述培養(yǎng)方法分別培養(yǎng)24、48 h。PBS洗滌細胞，多聚甲醛4 ℃固定20 min，hoechst33342 37 ℃染色10 min，PBS 洗片后，熒光顯微鏡下觀察和拍攝細胞凋亡狀況。

2.5 統(tǒng)計學方法

實驗數(shù)據(jù)以統(tǒng)計學軟件SPSS15.0 計算，所有實驗數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標準差表示，各組數(shù)據(jù)均進行正態(tài)檢驗及F 方差齊性檢驗。方差齊用單因素方差分析，P＜0.05 為差異有顯著性意義。

3 實驗結果

3.1 加味葦莖湯及芹菜素對A549 細胞形態(tài)的影響

結果顯示，空白對照組、空白血清組、DMSO 5‰組的細胞貼壁生長，幾乎無脫落，胞漿飽滿，舒展生長，貼壁牢固，相鄰細胞生長融合成片;含藥血清組及芹菜素組24、48 h 后出現(xiàn)不同程度細胞間連接不牢固，細胞逐漸脫落。脫落細胞懸浮于培養(yǎng)液中，細胞形態(tài)變圓，胞膜完整，顆粒感、體積縮小，核固縮出現(xiàn)，核顏色加深，折光性增強。以50 μmoL/L 的芹菜素組作用48 h 最為明顯。

3.2 加味葦莖湯及芹菜素對A549 細胞生長抑制率的影響

結果顯示，10%、5%、2.5%含藥血清作用于肺癌A549 細胞24 h 后，抑制率分別為31%、13%、10%;作用48 h 后，抑制率分別為45%、24%、8%，與空白對照組比較，差異均有非常顯著性意義(P＜0.01)。空白血清對該細胞生長無抑制作用。見表1。

芹菜素50、25、12.5、6.25 μmoL/L 作用于肺癌A549 細胞24 h 后，抑制率分別為34%、29%、28%、17%;作用48 h 后，抑制率分別為53%、44%、30%、9%，與空白對照組比較，差異均有非常顯著性意義(P＜0.01)。5‰ DMSO 對細胞有一定的毒害作用，但芹菜素組與DMSO 組比較，差異仍具有顯著性意義(P＜0.01)，見表2。

結果顯示:加味葦莖湯含藥血清及芹菜素對肺癌細胞A549 具有抑制作用，且呈一定的量效、時效關系。且作用相同時間后，芹菜素對細胞的抑制作用明顯高于含藥血清組。

表1 加味葦莖湯含藥血清對A549 細胞增殖的影響(±s，n=10，%)Table 1 Effect of Jiawei Weijing decoction (in blood serum)on the proliferation of A549 cells (±s，n=10，%)

表1 加味葦莖湯含藥血清對A549 細胞增殖的影響(±s，n=10，%)Table 1 Effect of Jiawei Weijing decoction (in blood serum)on the proliferation of A549 cells (±s，n=10，%)

注:與空白對照組比較 * P ＜0.05，＊＊P ＜0.01。Note:Compared to blank control group，* P ＜0.05，＊＊P ＜0.01.

表2 芹菜素對A549 細胞增殖的影響(±s，n=10，%)Table 2 Effect of apigenin on the proliferation of A549 cells (±s，n=10，%)

表2 芹菜素對A549 細胞增殖的影響(±s，n=10，%)Table 2 Effect of apigenin on the proliferation of A549 cells (±s，n=10，%)

注:與空白對照組比較 * P ＜0.05，＊＊P ＜0.01。Note:Compared to blank control group，* P ＜0.05，＊＊P ＜0.01.

3.3 加味葦莖湯及芹菜素對A549 細胞周期及凋亡率的影響

空白對照組DNA 組方圖為典型腫瘤細胞的G0/1 峰型。不同濃度含藥血清作用于肺癌A549 細胞后，G1 期細胞減少，G2 期細胞明顯增多，且時間越長、濃度越高，G2 期阻滯越明顯，并見細胞有凋亡。10%含藥血清作用細胞48 h 后，G2 期細胞比例由空白對照組的(6.50 ±0.30)增高至(34.80 ±0.74)%，是空白對照組的5.3 倍。空白血清組對細胞周期及凋亡無明顯影響，見表3(P＜0.01)。

不同濃度芹菜素作用于細胞后，G1 期細胞減少，G2 期細胞比例增加，但無劑量依賴性;48 h 細胞周期無明顯規(guī)律性改變，但凋亡率明顯增高，可見凋亡細胞形成的亞G1 峰，凋亡率隨著質量濃度增加而逐漸升高，并呈一定的時效關系，50 μmoL/L 作用48 h 后，凋亡率達20.74%。溶劑組(5‰DMSO)對細胞周期及凋亡無明顯影響，見表4(P＜0.01)。

結果顯示:加味葦莖湯含藥血清主要通過將A549 細胞阻滯于G2 期、阻止細胞進行有絲分裂來發(fā)揮抗腫瘤作用;而芹菜素主要通過誘導A549 細胞凋亡發(fā)揮抗腫瘤作用，其誘導細胞凋亡的作用明顯強于含藥血清組。

表3 加味葦莖湯含藥血清對A549 細胞周期及凋亡率的影響(±s，n=3，%)Table 3 Effect of Jiawei Weijing decoction (in blood serum)on the cell cycle and apoptotic rate of A549 cells (±s，n=3，%)

表3 加味葦莖湯含藥血清對A549 細胞周期及凋亡率的影響(±s，n=3，%)Table 3 Effect of Jiawei Weijing decoction (in blood serum)on the cell cycle and apoptotic rate of A549 cells (±s，n=3，%)

注:與空白對照組比較 * P ＜0.05，＊＊P ＜0.01。Note:Compared to blank control group，* P ＜0.05，＊＊P ＜0.01.

表4 芹菜素對A549 細胞周期及凋亡率的影響(±s，n=3，%)Table 4 Effect of apigenin on the cell cycle and apoptotic rate of A549 cells (±s，n=3，%)

表4 芹菜素對A549 細胞周期及凋亡率的影響(±s，n=3，%)Table 4 Effect of apigenin on the cell cycle and apoptotic rate of A549 cells (±s，n=3，%)

注:與空白對照組比較 * P ＜0.05，＊＊P ＜0.01。Note:Compared to blank control group，* P ＜0.05，＊＊P ＜0.01.

3.4 加味葦莖湯及芹菜素對A549 細胞凋亡的影響

熒光顯微鏡下結果顯示，不同濃度含藥血清及芹菜素處理細胞，細胞核在24、48 h 時間段中均有破裂，呈大小不等、形態(tài)不規(guī)則的碎片或呈梅花狀，呈較典型的細胞凋亡形態(tài)。其中以芹菜素50 μmoL/L、含藥血清10% 48 h 的凋亡細胞最多，且細胞脫落，視野內(nèi)細胞核數(shù)明顯減少。單培組、空白血清組細胞核完整且均勻分布，細胞平展，邊緣平滑，未見有凋亡形態(tài)的細胞核。DMSO5‰組有偶見有少量凋亡細胞存在。

4 討論

臨床實踐證明，肺癌初期，正氣尚未受損，體內(nèi)一派邪熱熾盛之象，熱灼津液，煉液為痰;熱邪耗傷脈內(nèi)陰血，血行澀滯，加之邪熱傷絡動血，導致瘀熱互結，從而出現(xiàn)咳嗽、咳痰、痰中帶血、發(fā)熱、胸脅刺痛、舌質深絳等證候。此時中醫(yī)治療以攻為主，治以清熱解毒、活血通絡、化痰散結［2］。清熱活血化痰法不僅可單獨用于肺癌實證初期，還可在顧護正氣的基礎上辨證使用，既能改善臨床癥狀，又具有放化療增效和減毒作用［3］。因此，清熱活血是臨床治療早期肺癌的主要方法，臨證常以此為原則組方用藥［4］。加味葦莖湯是以《備急千金要方》之葦莖湯加虎杖、半枝蓮而成，具有清肺化痰、逐瘀排膿的功效，芹菜素是其主要成分之一。

在肺癌發(fā)病機制中，痰瘀既是臟腑功能失調、邪毒蘊肺的病理產(chǎn)物，又是致使正氣內(nèi)虛、邪毒與之膠結成塊的致病因素，葦莖湯清肺化痰、逐瘀排膿，具攻邪之力［5］。虎杖利膽退黃，清熱解毒，活血化瘀，祛痰止咳;半枝蓮清熱解毒，化瘀利尿，兩味藥均是諸多醫(yī)家臨床治療肺癌的常用藥。本研究在葦莖湯基礎上伍以虎杖、半枝蓮，助葦莖湯清肺熱、逐肺淤，加強其抗肺癌作用。且現(xiàn)代藥理研究證實，該組方不僅可多種機制發(fā)揮抗腫瘤作用，而且富含芹菜素，加強了葦莖湯加味在本研究中的配伍意義。

芹菜素可通過抗氧化、調控腫瘤相關基因、影響腫瘤細胞信號傳導、誘導腫瘤細胞周期阻滯、誘導細胞凋亡［6］、抑制腫瘤血管形成及抑制腫瘤侵襲和轉移相關蛋白酶的活性［7］，以及放化療增敏、化學預防等多種途徑發(fā)揮抗腫瘤作用，與其它黃酮類物質(槲皮素、山奈黃酮)相比，芹菜素具有低毒、無誘變性等特點。

增殖能力增強、周期調節(jié)失控、凋亡異常是腫瘤細胞的重要生物學特點。本實驗首先采用MTT 法計算生長抑制率檢測腫瘤細胞分別經(jīng)不同濃度加味葦莖湯含藥血清及芹菜素處理后的增殖情況;為探究兩種藥物是否通過誘導凋亡抑制A549 細胞增殖，進行了hoechst33342 熒光染色實驗;在此基礎上，為明確兩種藥物作用細胞后的凋亡率，及探究是否會通過周期阻滯抑制A549 細胞增殖，進行了流式細胞儀PI 染色法。實驗結果顯示:加味葦莖湯含藥血清組及芹菜素組均能抑制A549 細胞增殖，并呈現(xiàn)一定的量效、時效關系;兩組藥均能誘導肺癌A549 細胞的凋亡，提示加味葦莖湯含藥血清、芹菜素抑制肺癌A549 細胞的增殖都能通過誘導細胞凋亡這個途徑發(fā)揮作用;兩組藥對A549 細胞周期均產(chǎn)生了影響，與空白對照組比較，周期分布有了明顯變化(P＜0.05)。但兩組藥對A549 細胞作用后，各指標數(shù)據(jù)差距明顯:作用相同時間后，芹菜素50 μmoL/L 組(最高濃度)對細胞的抑制作用明顯高于10%含藥血清組(最高濃度)(P＜0.01)，說明在本實驗濃度梯度設置范圍內(nèi)，芹菜素對A549 細胞的增殖抑制作用優(yōu)于加味葦莖湯含藥血清;熒光顯微鏡下，芹菜素作用A549 細胞后，脫落細胞數(shù)、凋亡小體明顯多于含藥血清組，且根據(jù)流式檢測細胞凋亡率，芹菜素組誘導細胞凋亡作用明顯優(yōu)于含藥血清組(P＜0.01)，進一步證明了芹菜素使肺癌A549細胞凋亡明顯增加，與增殖抑制實驗數(shù)據(jù)相符，提示芹菜素主要是通過誘導凋亡方式抑制A549 細胞的生長;周期阻滯方面，加味葦莖湯含藥血清主要通過將A549 細胞阻滯于G2 期，阻止細胞進行有絲分裂來發(fā)揮抗腫瘤作用;芹菜素對細胞也有G2 期阻滯作用，但未呈現(xiàn)量效時效關系。

綜上所述，加味葦莖湯含藥血清及芹菜素引起的腫瘤生物學變化包括生長抑制、細胞周期阻滯及細胞凋亡，且不同生物學變化與藥物濃度與作用時間關系密切，加味葦莖湯含藥血清主要是通過將A549 細胞阻滯于G2 期抑制腫瘤細胞增殖，而芹菜素主要指通過誘導細胞凋亡發(fā)揮抗腫瘤作用，其具體抗癌機制還有待進一步實驗研究。中藥單體的研究在明確其生化作用的基礎上，豐富中藥復方的現(xiàn)代藥理研究，促進具有“穩(wěn)中求勝”特性的中醫(yī)藥國際化。中藥復方作為中醫(yī)藥臨床最傳統(tǒng)最主流的方法，對其研究更有臨床指導意義。

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