香辛植物精油對常見呼吸道致病菌氣相抗菌作用的研究

吳克剛，林雅慧，柴向華，趙欣欣

1廣東工業大學輕工化工學院食品科學與工程系，廣州 510006;2 廣州甘蔗糖業研究所，廣州 510316

空氣中存在著許多細菌和病毒等微生物，尤其是人口密集區，其成為傳播疾病的媒介。空氣中的微生物主要來源于土壤、水體表面、動植物、人體及生產活動、污水污物處理等，以氣溶膠形式存在，是引發各種呼吸道傳染病的根源［1］。微生物氣溶膠主要引起一些呼吸道疾病，如黏膜刺激、支氣管炎、過敏性鼻炎、哮喘、外源過敏性肺泡炎及一些吸入性感染等。由于人們絕大部分的時間都是在室內度過，因而防止、控制室內空氣微生物污染尤為重要，有效的空氣凈化消毒是控制室內空氣微生物污染、預防疾病發生、保障身體安全的重要措施之一。目前室內空氣消毒主要包括紫外線燈、空氣層流室、負離子發生器等物理方法以及臭氧、熏蒸劑、過氧化氫、含氯表面消毒劑、中草藥制劑等化學方法［2］。植物釋放的揮發性有機物質，能把飄浮在大氣中的病原微生物殺死，從而起到了空氣消毒、凈化作用，如研究表明許多芳香植物精油具有較強的抗菌活性，可揮發擴散到空氣形成氣相，發揮空氣消毒作用［3，4］。本文主要研究比較香辛植物精油對幾種常見呼吸道致病菌的氣相抗菌活性，為其應用于空氣消毒提供重要的參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

供試菌種:金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)ATCC 26001、溶血性鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)ATCC 19615、大腸桿菌(Escherichia coli)ATCC 25922、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella peneumoniae)ATCC 10031、銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)ATCC 9027 由廣東出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心提供;肺炎鏈球菌(Streptococcus pyogenes)ATCC 12344 由廣東省微生物研究所提供。

香辛植物精油:山蒼籽油、丁香油、肉桂油、八角茴香油、迷迭香油由廣東工業大學食品添加劑與食品安全研究室提供;薄荷油、桉葉油、茶樹油、芳樟油、甜橙油、香檸檬油、甘牛至油、香紫蘇油由廣州百花香料股份有限公司提供。

培養基:營養瓊脂、腦心浸膏(BHI)瓊脂、緩沖蛋白胨(BP)購于廣東環凱微生物科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌種活化及菌懸液的配制

取菌種于營養肉湯(或BHI 肉湯)活化24 h，平板分離單個菌落，挑取單個菌落制得0.5 麥氏單位(1.5 ×108CFU/mL)的菌懸液。

1.2.2 氣相熏蒸法測MIC 和MBC

參考Lopez 的氣相揮發試驗［4］。含定量凝固培養基的平皿上加入100 μL 105～106CUF/mL 的菌懸液，用已滅菌的三角玻棒涂抹均勻。待菌液被吸收后倒置放置。取上述稀釋的精油，均勻滴在無菌濾紙片上，置于皿蓋內側中心形成精油氣相氛圍，取等量的丙二醇作為對照，另設一空白組，每組做3 個平行。抑菌實驗直接將此培養皿蓋好用封口膜密封;37 ℃培養24 h，觀察記錄菌體在培養皿的生長情況。殺菌實驗取抑菌實驗中無菌生長的平板，在無菌環境更換培養皿蓋，用封口膜密封，于37 ℃培養24 h 后觀察實驗結果。如果將氣相氛圍移除，細菌開始生長，則該濃度為最小抑菌濃度(Minimal Inhibitory Concentration，MIC);而仍然沒有細菌生長則說明細菌被殺滅，該濃度就是最小殺菌濃度(Minimal Bactericidal Concentration，MBC)。

2 結果與討論

2.1 植物精油對3 種革蘭氏陽性呼吸道致病菌的氣相抗菌作用

溶血性鏈球菌(Streptococcus pyogens)廣泛存在于自然界和人及動物糞便和健康人的鼻咽部，是急性呼吸道感染尤其是上呼吸道感染的重要病原菌，也是臨床上最重要的鏈球菌，常引起咽喉炎、扁桃體炎、鼻竇炎、中耳炎、扁桃體周圍膿腫等呼吸道感染及一些嚴重變態反應性并發癥［5］。肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)是急性呼吸道感染主要的條件致病菌，能引起的疾病有肺炎、支氣管炎、支氣管肺炎、中耳炎、腦膜炎和敗血癥等［6］，目前肺炎鏈球菌對青霉素、紅霉素、大環內酯、四環素、復方磺胺、氯霉素等的多重耐藥性，其臨床上的耐藥情況非常嚴重。金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，S.aureus)在自然界中無處不在，是一個非常重要的社區獲得性和醫院獲得性病原菌，能夠引起多種人體或動物局部和全身感染，而且其非常善于避開宿主的免疫系統，對多種抗生素產生抗性［7］。為此，實驗以溶血性鏈球菌、肺炎鏈球菌、金黃色葡萄球菌3種革蘭氏陽性呼吸道致病菌為研究對象，研究香辛植物精油對其氣相抗菌作用，結果如表1 所示。

表1 香辛植物精油對3 種革蘭氏陽性呼吸道致病菌的MIC 和MBC(μL/L)Table 1 MIC and MBC values of essential oils against Gram-positive respiratory pathogens (μL/L)

實驗結果可見，金黃色葡萄球菌、溶血性鏈球菌、肺炎鏈球菌對13 種植物精油均較為敏感，總體抗菌活性大小依次為:芳樟油、薄荷油(亞洲)、山蒼籽油＞香紫蘇油＞香檸檬油＞迷迭香油、桉葉油＞茶樹油、甘牛至油＞八角茴香油＞甜橙油＞肉桂油＞丁香油。除了肉桂油、丁香油、甜橙油、八角茴香油外，其他植物精油對3 種革蘭氏陽性呼吸道致病菌的MIC 和MBC 均未超過1000 μL/L，其中香紫蘇油、香檸檬油、迷迭香油、桉葉油不超過500 μL/L，特別是芳樟油、薄荷油(亞洲)、山蒼籽油在250 μL/L 就可對3 種革蘭氏陽性均產生抑菌、殺菌作用。13 種供試植物精油中，甜橙油對溶血性鏈球菌抗菌效果最好，但對金黃色葡萄球菌抗菌效果最差;丁香油對金黃色葡萄球菌抗菌效果最好，但對溶血性鏈球菌、肺炎鏈球菌抗菌效果最差。3 種革蘭氏陽性呼吸道致病菌中溶血性鏈球菌對植物精油最為敏感，除丁香油、八角茴香油外，其它植物精油的MIC和MBC 均未超過500 μL/L，這與溶血性鏈球菌的抵抗力有關，它對常用消毒劑敏感，60 ℃30 min 即被殺死，對青霉素、紅霉素、氯霉素、四環素、磺胺均敏感，很少有耐藥性。

2.2 香辛植物精油對3 種革蘭氏陰性呼吸道致病菌的氣相抗菌作用

大腸桿菌(Escherichia coli，E.coli)是人和動物腸道中的一種共棲菌，多數致病性大腸桿菌都能夠通過消化道、接觸感染以及通過形成氣溶膠造成呼吸道感染，常被用作環境、水、食品衛生污染的指示菌。肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae，K.pneumoniae)廣泛分布于自然界，是人和動物腸道、呼吸道、泌尿生殖道的致病菌，可在全身各部位發生感染，但最高的發病率在尿路和呼吸道［8］。近年來該菌成為僅次于大腸桿菌的最重要的致病菌。銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa，P.aeruginosa)又名綠膿桿菌，是假單胞菌中最常見的院內感染條件致病菌，正常情況下并不感染人體任何組織，一般是在宿主的正常防御機制發生改變或損傷(如長期使用激素、進行腫瘤化療、放療等導致免疫功能低下或者燒傷時致病)，因此它屬于條件致病菌［9］，極易在醫院內人群中引起嚴重的感染，是醫院獲得性肺炎、醫院獲得性泌尿道感染、外科創傷感染，燒傷性感染和血液感染的主要病原體。為此，實驗以大腸桿菌、肺炎克雷伯氏菌、銅綠假單胞菌3 種革蘭氏陰性呼吸道致病菌為研究對象，研究香辛植物精油對其氣相抗菌作用，結果如表2 所示。

實驗結果可見，與革蘭氏陽性呼吸道致病菌比較，大腸桿菌、肺炎克雷伯氏菌、銅綠假單胞菌3 種革蘭氏陰性呼吸道致病菌明顯對13 種植物精油不太敏感，需要較高的濃度才能抑制、殺滅3 種菌?？傮w抗菌活性大小依次為:迷迭香油＞茶樹油＞山蒼籽油＞肉桂油＞桉葉油＞芳樟油＞甘牛至油＞八角茴香油＞丁香油＞甜橙油＞薄荷油(亞洲)＞香紫蘇油＞香檸檬油。迷迭香油濃度達到1000 μL/L 時可對3 種革蘭氏陰性均產生抑菌、殺菌作用。13 種供試植物精油中，茶樹油和芳樟油對大腸桿菌、肺炎克雷伯氏菌抗菌效果最好，但對銅綠假單胞菌抗菌效果稍差;迷迭香油對銅綠假單胞菌抗菌效果最好。3 種革蘭氏陰性呼吸道致病菌中大腸桿菌對植物精油最為敏感，銅綠假單胞菌最不敏感。其他學者在研究植物精油的抗菌作用時也一致發現銅綠假單胞菌是最不敏感的細菌［4］。有研究表明銅綠假單胞菌對多種不同抗生素高度耐藥，這歸因于其外膜通透性很低、產生抗生素修飾酶、降低抗生素作用位點敏感性、降低抗生素通透性的作用機制［10］。

表2 香辛植物精油對3 種革蘭氏陰性呼吸道致病菌的MIC 和MBC(μL/L)Table 2 MIC and MBC values of essential oils against Gram-negative respiratory pathogens (μL/L)

3 結論

利用植物精油的揮發氣相抗菌活性控制空氣致病性微生物是一種綠色、安全的空氣凈化消毒方法。金黃色葡萄球菌、溶血性鏈球菌、肺炎鏈球菌3 種革蘭氏陽性呼吸道致病菌對13 種香辛植物精油均較為敏感，特別是芳樟油、薄荷油(亞洲)、山蒼籽油抗菌活性很高，MIC 和MBC 均為250 μL/L;大腸桿菌、肺炎克雷伯氏菌、銅綠假單胞菌3 種革蘭氏陰性呼吸道致病菌明顯對13 種香辛植物精油不太敏感，需要較高的濃度才能抑制、殺滅，其中迷迭香油抗菌活性較高，MIC 和MBC 為1000 μL/L;6 種呼吸道致病菌中銅綠假單胞菌對13 種香辛植物精油最不敏感，這與其對多種抗生素高度耐藥機制類似。

1 Julianne L，Helen AC，William RB，et al.Plants as sources of airborne bacteria，including ice nucleation-active bacteria.Appl Environ Microbiol，1982，44:1059-1063.

2 Zhan YJ(占雅靜)，Chen Q(陳清).The research advances of indoor air disinfection.J Prac Med(實用醫學雜志)，2007，23:3967-3969.

3 Inouye S，Takizawa T，Yamaguchi H.Antibacterial activity of essential oils and their major constituents against respiratory tract pathogens by gaseous contact.J Antimicrob Chemother，2001，47:565-573.

4 Patricia L，Cristina S，Ramon B，et al.Vapor-phase activities of cinnamon，thyme，and oregano essential oils and key constituents against foodborne microorganisms.J Agric Food Chem，2007，55:4348-4356.

5 He GQ(何國琴)，Luo ZX(羅征秀)，Fu Z(符州).Research progress on the macrolide antibiotics drug-resistance of group AStreptococcus pyogens.Chin J Microecol(中國微生態學雜志)，2009，21:80-81.

6 Chen R(陳蓉)，Zhao GM(趙根明).Research progress of macrolide resistance inStreptococcus pneumoniae.Chin J Infec Chemother(中國抗感染與化療雜志)，2010，10:230-233.

7 Senn MM，Giachino P，Homerova D，et al.Molecular analysis and organization of the σB operon in Staphylococcus aureus.J Bacteriol，2005，187:8006-8019.

8 Allan R.The etiology of urinary tract infection:traditional and emerging pathogens.Amer J Med，2003，49(2):71-82.

9 Masuda N，Sakagawa E，Ohya S.Outer membrane proteins responsible for multiple drug resistance inPseudomonas aeruginosa.Antimicro Agen Chemo，1995，39:645-649.

10 Hancock RE.The bacterial outer membrane as a drug barrier.Trends Microbiol，1997，5:37-42.