羧甲基殼聚糖金屬配合物的抗氧化活性研究

馮小強，李小芳，楊 聲，陳學(xué)喜

1天水師范學(xué)院化學(xué)工程與技術(shù)學(xué)院，天水 741001;2 定西師范高等專科學(xué)校，定西 743000

氧化和機體的衰老、病變密切相關(guān)［1］。天然抗氧化劑因抗氧化效率高，作用時間長，熱穩(wěn)定性好，對人體毒副作用小等特點而成為研究的熱點［2］。殼聚糖(簡寫CS)是一種天然堿性高分子多糖，對人體無毒、可生物降解和多種生物活性，其中抗氧化活性顯得尤為重要，但殼聚糖溶解性差這一缺陷在很大程度上限制了它的應(yīng)用。羧甲基殼聚糖(簡寫CMC)與CS 相比溶解性好，具有許多獨特的性質(zhì)，且由于羧基基團的引入，使得更容易與多種過渡金屬離子配位。研究表明，CMC 具有抗脂質(zhì)氧化的作用，使兔血清中氧化型低密度脂蛋白及丙二醛含量降低，抑制了脂質(zhì)的過氧化［3］。當濃度為1.2 mg/mL 時，CMC 對超氧陰離子自由基的清除率達到了13.4%［4］。但就CMC 金屬配合物的抗氧化活性的研究卻鮮有報道。本實驗從清除羥基自由基(·OH)、超氧負離子自由基和總還原能力這三個方面，分別考察了CS、CMC 及CMC 金屬配合物的抗氧化活性，并考察了金屬離子的含量對配合物抗氧化活性的影響。

1 實驗部分

1.1 材料與儀器

CS、CMC 及配合物用1.0% HAc 溶解，配成濃度為0.1、0.2、0.3、0.4 和0.5 mg/mL 溶液。UV-9200 型分光光度計，北京瑞利儀器有限公司。

1.2 抗氧化活性

2 結(jié)果與討論

2.1 CMC 金屬配合物的制備

將6.0 g 殼聚糖、60 mL 異丙醇加入三口燒瓶攪拌均勻，在60 ℃下溶脹2 h。逐滴加入40 mL 9.5 mol/L NaOH，讓殼聚糖在堿性條件下形成堿中心，攪拌30 min。將12 g 一氯乙酸用蒸餾水溶解，緩慢滴加到上述體系中。反應(yīng)4 h 后，調(diào)pH 值至中性，抽濾，沉淀依次用70%乙醇、無水乙醇洗滌，干燥得CMC。

稱取0.5 g CMC 用蒸餾水溶解，50 ℃攪拌下向其中加入一定量的CuCl2，使得CMC 與Cu2+的物質(zhì)的量比分別為1∶1、1∶2、2∶1、3∶2、2∶3，或分別加入等摩爾的CoCl2·6H20、AgNO3，反應(yīng)3 h 后，將沉淀陳化、抽濾、洗滌、干燥，分別得CMC-Cu 配合物(依次記 作CMC-Cu11、CMC-Cu12、CMC-Cu21、CMCCu32 和CMC-Cu23)、CMC-Co 配合物和CMC-Ag 配合物。

2.2 ·OH 的清除實驗

·OH 是毒性最大的活性氧，對細胞內(nèi)DNA 的破壞作用最大，它可以加成至堿基雙鍵中造成堿基破壞，從而產(chǎn)生突變。CMC 金屬配合物對羥自由基均具有不同程度的清除效果，并且隨著樣品質(zhì)量濃度的增大，對羥自由基清除率逐漸提高，如圖1a 所示。相比之下，對·OH 的清除作用從強到弱依次是CMC-Cu11 ＞CMC-Co ＞CMC-Ag ＞CMC ＞CS。當濃度均為0.2 mg/mL 時，不同摩爾配比得到的CMC-Cu 清除·OH 能力存在差異，如圖1b 所示，CMC-Cu11 對羥自由基的清除作用最強，CMC-Cu32次之。

圖1 CS、CMC、CMC 配合物清除·OH 的能力(a)及Cu2+含量對CMC-Cu 清除·OH 能力的影響(b)Fig.1 ·OH scavenging capacity of CS，CMC and CMC complexes (a)and the effect of Cu2+ on ·OH scavenging capacity of CMC-Cu (b)

CS 可通過三種途徑清除羥基自由基［6］;(1)羥基的氫原子與·OH 作用而達到目的;(2)氨基與·OH 反應(yīng)生成穩(wěn)定的大分子自由基;(3)氨基先與溶液中的氫作用形成氨正離子，在與·OH 作用形成穩(wěn)定物質(zhì)。CMC 中的氨基和羥基被乙羧基取代，是的與·OH 反應(yīng)的數(shù)量減少，但是，乙羧基作為吸電子基團，能降低殼聚糖分子鏈上的電子云密度，使得分子內(nèi)、分子間生成氫鍵的幾率降低，故增強了氨基和羥基與·OH 反應(yīng)的活性。因此，CMC 清除羥自由基的能力強于CS 本身。

2.4 還原能力測定

還原能力是表示抗氧化物質(zhì)提供電子能力的重要指標，研究表明抗氧化活性和還原能力之間存在著密切的關(guān)系。通常采用鐵氰化鉀法測定700 nm的吸光度，來反映還原能力的強弱。一般吸光度值越大，則還原能力越強。隨CMC-Ag、CMC-Cu11、CMC-Co、CMC 和CS 濃度的升高，吸光度值均有所增強，其變化趨勢如圖3a 所示，說明它們通過提供電子，阻斷Fe2+向Fe3+的轉(zhuǎn)變，表現(xiàn)出一定的還原能力。在較高濃度下還原能力從強到弱依次是CMC-Co ＞CMC-Ag ＞CMC-Cu ＞CMC ＞CS。當濃度均為0.2 mg/mL 時，不同摩爾配比的CMC-Cu 還原能力也存在差異，如圖3b 所示，CMC-Cu21 的還原能力遠遠強于其它4 種配合物的還原力。

圖2 CS、CMC、CM 配合物清除的能力(a)及Cu2+含量對CMC-Cu 清除的影響(b)Fig.2 scavenging capacity of CS，CMC and CMC complexes (a)and effect of Cu2+ on scavenging capacity of CMC-Cu (b)

圖3 CS、CMC、CM 配合物的還原能力(a)及Cu2+含量對CMC-Cu 還原能力的影響(b)Fig.3 Reducing power of CS，CMC and CMC complexes (a)and effect of Cu2+ on reducing power of CMC-Cu (b)

2.5 討論

CMC 分子中存在大量N-H、O-H 和-COOH 基團，它們能與自由基發(fā)生反應(yīng)，故對自由基有一定的清除能力。另外過渡金屬的d 軌道電子較活潑，且有缺電子的空軌道，因此過渡金屬易得失電子，金屬離子可與自由基發(fā)生反應(yīng)，在自由基氧化過程中起催化劑作用，表現(xiàn)出一定的抗氧化活性。實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CMC 金屬配合物的抗氧化活性強于CMC 和CS 本身，可能是由于羧基參與配位使配合物的構(gòu)型發(fā)生改變，金屬離子和CMC 的協(xié)同作用所致。

3 結(jié)論

CMC-Ag、CMC-Cu 和CMC-Co 均具有很好的抗氧化能力，抗氧化性隨濃度的增加而增強，且與配合物中金屬離子的含量有關(guān)。該研究為殼聚糖衍生物的開發(fā)、為尋找天然抗氧化劑提供了新的思路。

1 Brawn K，F(xiàn)ridovich I.DNA strand scission by enzymically generated oxygen radicals.Arch Biochem Biophys，1981，206:414-419.

2 Ye WC，F(xiàn)an CL，Zhang LH，et al.A new phenolic glycoside from the roots ofLygodium japonicum.Phytochem Commun，2007，78:600-601.

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5 Feng XQ (馮小強)，Li XF(李小芳)，Yang S(楊聲)，et al.Optimization of extraction process of antioxidant components from orange peel and determination of its antioxidant activity.Hunan Agric Sci(湖南農(nóng)業(yè)科學(xué))，2012，21:86-88.

6 Xie WM，Xu PX，Liu Q.Antioxidant activity of water-soluble chitosan derivatives.Bioorg Med Chem Lett，2001，11:1699-1701.