人參、刺五加提取物對鏈脲佐菌素誘導糖尿病小鼠的降糖作用研究

張 南，李 娜，李佳琳，馬 坤，崔 龍

北華大學藥學院，吉林 132013

人參為五加科植物人參Panax ginsengC.A.Mayer 的干燥根及根莖，在我國傳統醫學中人參作為一味名貴中草藥，在古代醫學書籍《神農本草經》中記載人，參有“補五臟，安精神，定魂魄，止驚悸，除邪氣，明目開心益智”之功效。經現代科學研究表明，人參作為一種強壯滋補藥具有增強機體抵抗力，降壓強心，提高機體免疫力［1］，抗衰延壽和改善記憶功能［2］等方面的作用。刺五加又名五加參，刺拐棒，為五加科植物刺五加Acanthopanax senticosus(Rupr.et Maxim.)Harms 的干燥根及根莖或莖。民間有“寧得一把五加，不用金玉滿車”的說法。《本草綱目》亦有記載稱其能夠“補中益氣，堅筋骨，強意志，久服輕身耐老”。

雖然已有研究報道人參和刺五加具有降低血糖的效果，但經文獻檢索未見有關人參與刺五加配伍后對血糖影響的研究。本研究從中國傳統醫學“藥食同源”的觀點出發，探討人參、刺五加配伍藥物對STZ 誘導糖尿病小鼠的降糖作用。

1 材料與儀器

1.1 人參和刺五加

人參和刺五加采自東北長白山通化地區。人參為5年生以上園參，經延邊大學李鎬教授鑒定為五加科植物人參Panax ginseng的干燥根及根莖。標本藏于北華大學藥學院藥物化學實驗室(標號為:RS20120827)。刺五加樣品經延邊大學李鎬教授鑒定為五加科植物刺五加Acanthopanax senticosusHarms 的干燥莖。標本藏于北華大學藥學院藥物化學實驗室(標號為:CWJ20120910)。

1.2 藥品與試劑

鏈脲佐菌素(STZ)購自Sigma 公司(SO130-1G)，降糖靈片購自南通制藥總廠，檸檬酸三鈉和檸檬酸購自天津市化學試劑一廠，葡萄糖試劑盒購自北京北化康泰臨床試劑有限公司，超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒與丙二醛(MDA)試劑盒購自南京建成生物工程研究所，碘［1251］胰島素放射免疫分析藥盒購自上海瑞齊生物科技有限公司。STZ 溶液的配置:用0.1 mol/L 檸檬酸緩沖液(pH 4.5)溶解STZ 粉劑，制成1% STZ 液，現配先用且應避光低溫保存。其余試劑均為市售分析純。

1.3 儀器與設備

Centrifuge 5430R 型高速離心機，德國Eppendorf公司;Infinite200 多功能酶標儀，瑞典TECAN 公司;EYELA CA1111 型旋轉蒸發儀，日本東京理化公司。

1.4 實驗動物

ICR 鼠140 只，雄性，SPF 級，體重21～25 g，由吉林大學基礎醫學院動物實驗中心提供，許可證號碼SCXK(吉)-2011-0004。飼養于北華大學藥理教研室動物實驗中心，各組動物均在同樣環境下飲水、攝食。

2 試驗方法

2.1 實驗樣品的制備

取干燥人參切片800 g 平均分成4 組，每組200 g。分別加入5 倍體積的100% 乙醇，75% 乙醇，50%乙醇和水。采用加熱回流提取法提取3 h，120目尼龍布過濾，濾渣重復提取2 次，每次3 h。將3次所得濾液合并，用真空干燥濃縮后與水混懸，經正己烷萃取3 次后將水層溶液真空干燥濃縮，得到棕色浸膏，低溫干燥得到棕色干燥固體即為人參提取物。

取干燥刺五加粉碎莖1000 g 加入6 倍體積的75%乙醇溶液。采用加熱回流提取法提取3 h，120目尼龍布過濾。濾渣重復提取2 次，每次3 h。將三次所得濾液合并，提取液真空干燥濃縮后與水混懸，經正己烷，乙酸乙酯依次萃取3 次后將水層溶液真空干燥濃縮，得到棕色浸膏，低溫干燥得到棕色干燥固體即為刺五加乙醇提取物。

4 組不同濃度人參乙醇提取物分別與刺五加75%乙醇提取物按質量比為2∶1 的比例進行配伍，即人參100%乙醇提取物與刺五加75%乙醇提取物配伍;人參75%乙醇提取物與刺五加75%乙醇提取物配伍;人參50%乙醇提取物與刺五加75%乙醇提取物配伍;人參水提取物與刺五加75%乙醇提取物配伍。每組配伍藥物分別配制高劑量(400 mg/kg·d)和低劑量(200 mg/kg·d)兩種溶液，共得到8 組成分不同的樣品溶液。按照上述順序，高劑量(400 mg/kg·d)組溶液依次標注為A-HG 組溶液、B-HG組溶液、C-HG 組溶液、D-HG 組溶液。低劑量組(200 mg/kg·d)溶液，依次標注為A-LG 組溶液、BLG 組溶液、C-LG 組溶液、D-LG 組溶液。

2.2 動物模型的建立與分組

健康ICR 種，2月齡，體重21～25 g 雄性小鼠140 只。適應性喂養1 w 后，隨機分成正常對照組(10 只)和糖尿病造模組(130 只)。造模組小鼠禁食16 h 后經腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ)70 mg/kg體重，正常對照組動物腹腔注射等劑量的生理鹽水作為對照，連續腹腔注射5 d。末次注射7 d 后，動物禁食16 h，尾靜脈斷尾取血測量空腹血糖值(FBG)，選取FBG≥16.7 mmol/L 者作為糖尿病模型組。

選取造模成功的實驗性糖尿病小鼠100 只隨機分成10 組。模型組(MC)，優降糖組(GC)，人參、刺五加配伍藥物高劑量(400 mg/kg)A-HG、B-HG、C-HG、D-HG 四個組，人參、刺五加配伍藥物低劑量(200 mg/kg)A-LG、B-LG、C-LG、D-LG 四個組。每組10 只動物。人參、刺五加配伍藥物給藥組每日上午定時灌胃給藥，各組所給藥物與上訴配得溶液相對應，連續灌胃6 w;模型對照組和正常對照組用等劑量的生理鹽水灌胃6 w。優降糖組每日灌胃4 mg/kg 降糖靈片，連續6 w。

2.3 觀察指標及檢測方法

2.3.1 日常觀察指標

試驗期間觀察動物精神、活動、毛色及尿量變化情況，每天測量一次體重。

2.3.2 對STZ 誘導高血糖小鼠體重變化試驗

正常對照組、模型組、優降糖組及8 個給藥組，每日上午灌胃給藥前，各組動物稱量一次體重。

2.3.3 空腹血糖(FBG)、空腹胰島素(Fins) 測定和胰島素敏感指數(ISI) 計算

正常對照組、模型組、優降糖組及8 個給藥組，在連續灌胃給藥14、28、42 d 時分別進行空腹血糖值測定，末次給藥后測定空腹胰島素值。所有動物在剪尾取血前均禁食并自由飲水，禁食16 h 后剪尾取末梢血0.2 mL，3000 rpm 離心15 min，取血清用于檢測FBG 和Fins 含量。血糖采用葡糖糖氧化酶法測定;血清胰島素采用放射免疫法測定;胰島素敏感指數采用ISI=In/［1/(血清空腹血糖×血清空腹胰島素)］計算。

2.3.4 糖耐量試驗

正常對照組、模型組、優降糖組及8 個給藥組，在末次剪尾取血后給藥一次，并在給藥后0.5 h 給以葡萄糖2.5 g/kg 體重灌胃，在給葡萄糖后0.5 h、1 h、2 h 尾靜脈采血測血糖含量。

2.3.5 對STZ 誘導高血糖小鼠血清SOD 活性與MDA 含量檢測

正常對照組、模型組、優降糖組及8 個給藥組，在連續灌胃給藥6 w 后，剪尾取血，分離血清，采用黃嘌呤氧化法測定血清中SOD 含量，采用TBA 法測定MDA 含量。

2.4 統計方法

采用SPSS16.0 軟件進行統計分析，多組計量資料采用one-way ANOVA，方差齊時采用LSD 法，方差不齊時采用Tamhane's T2 法。顯著性界定為0.05，所有數據以均數±標準差表示。

3 實驗結果

3.1 日常觀察

試驗期間模型組動物呈現明顯的“三多一少”癥狀，飲食、飲水量明顯增多，尿量明顯增多的現象，需要每日更換墊料。在后期糖尿病小鼠出現精神變差，活力減退，皮毛松散和體重下降等情況。正常對照組小鼠精神狀態，飲食，尿量等在給藥前后均未見明顯差別。

3.2 對STZ 誘導高血糖小鼠體重變化的影響

給藥1 w 后各組小鼠與正常組小鼠比較體重均呈明顯下降趨勢。人參、刺五加配伍藥物給藥組連續給藥2 w 后可觀察到除D-LG 和GC 外，其他各劑量組小鼠體重均有所上升。連續給藥6 w 后，配伍藥物給藥組，各劑量組小鼠體重均逐步增加。C-HG糖尿病小鼠體重與模型組動物比較，體重增加明顯(P＜0.01)。表明人參、刺五加配伍藥物能夠有效緩解糖尿病小鼠消瘦癥狀，對糖尿病小鼠體重下降具有一定的治療與恢復作用，見圖1。

圖1 人參、刺五加配伍藥物對STZ 誘導高血糖小鼠體重的影響(n=10，± s)Fig.1 Effect of P.ginseng and A.senticosus extract on the body weights of STZ-induced diabetic mice (n=10，± s)

3.3 對STZ 誘導高血糖小鼠空腹血糖的影響

模型組動物FBG 值較正常對照組顯著升高，證明動物模型造模成功。人參、刺五加配伍藥物各劑量組給予動物14、28、42 d 時FBG 值較模型組均下降(P＜0.01 或P＜0.05)。C-HG 對STZ 誘導高血糖小鼠的FBG 值影響最為明顯(P＜0.01)，能夠顯著降低其空腹血糖值，見表1。

3.4 對STZ 誘導高血糖小鼠胰島素敏感性的影響

在連續給人參、刺五加配伍藥物6 w 后，與正常對照組比較，模型對照組小鼠血清胰島素含量增加(P＜0.01);與模型對照組比較，人參、刺五加配伍藥物給藥組，各劑量組小鼠的ISI 值均有不同程度的回升，B-HG 和C-HG 對STZ 誘導高血糖小鼠的胰島素敏感性有顯著改善(P＜0.05)，此結果提示人參、刺五加降低糖尿病小鼠血糖值可能與其能夠提高胰島素敏感性相關，見表2。

表1 人參、刺五加配伍藥物對STZ 誘導高血糖小鼠空腹血糖的影響(n=10，± s)Table 1 Effect of P.ginseng and A.senticosus extract on blood glucose in diabetic mice induced by STZ (n=10，± s)

表1 人參、刺五加配伍藥物對STZ 誘導高血糖小鼠空腹血糖的影響(n=10，± s)Table 1 Effect of P.ginseng and A.senticosus extract on blood glucose in diabetic mice induced by STZ (n=10，± s)

注:與正常組比較，#P ＜0.01;與模型對照組比較，* P ＜0.05，＊＊P ＜0.01。下同。Note:Compare with NC，#P ＜0.01;Compare with MC，* P ＜0.05，＊＊P ＜0.01.Same as below.

表2 人參、刺五加配伍藥物對STZ 誘導高血糖小鼠胰島素敏感性的影響(n=10，± s)Table 2 Effect of P.ginseng and A.senticosus extract on insulin sensitivity in diabetic mice induced by STZ (n=10，± s)

表2 人參、刺五加配伍藥物對STZ 誘導高血糖小鼠胰島素敏感性的影響(n=10，± s)Table 2 Effect of P.ginseng and A.senticosus extract on insulin sensitivity in diabetic mice induced by STZ (n=10，± s)

3.5 對STZ 誘導高血糖小鼠糖耐量的影響

由表3 可見，小鼠灌服葡糖0.5 h 后，各組小鼠血糖值均較0 h 顯著上升，各組間無明顯差異。1、2 h 時人參、刺五加配伍藥物給藥組小鼠血糖值均不同程度的低于糖尿病模型組(P＜0.01 或P＜0.05)，表現出較好的降糖效果，表明人參、刺五加配伍藥物對糖尿病小鼠的葡糖糖耐受能力具有一定的改善作用。

3.6 對STZ 誘導高血糖小鼠血清SOD 活性與MDA 含量的影響

與正常對照組比較，模型組小鼠血清SOD 活力顯著降低，MDA 含量顯著升高。說明糖尿病小鼠抗氧化防御體系受到STZ 的影響，氧化應激增加，自由基產生率大于清除率。與模型組比較，人參刺五加提取物能夠顯著對抗STZ 的作用，8 個配伍藥物治療組的SOD 活力都表現出明顯的上升，MDA 含量顯著下降(P＜0.01 或P＜0.05)。C-HG 對STZ誘導高血糖小鼠血清SOD 活性與MDA 含量的影響尤為顯著(P＜0.01)，見表4。

表3 人參、刺五加配伍藥物對STZ 誘導高血糖小鼠糖耐量的影響(n=10，± s)Table 3 Effect of P.ginseng and A.senticosus extract on glucose tolerance in diabetic mice induced by STZ (n=10，± s)

表3 人參、刺五加配伍藥物對STZ 誘導高血糖小鼠糖耐量的影響(n=10，± s)Table 3 Effect of P.ginseng and A.senticosus extract on glucose tolerance in diabetic mice induced by STZ (n=10，± s)

表4 人參、刺五加配伍藥物對STZ 誘導高血糖小鼠血清SOD 活性和MDA 含量的影響(n=10， ± s)Table 4 Effect of P.ginseng and A.senticosus extract on serum SOD and the content of MDA in diabetic mice induced by STZ (n=10，± s)

表4 人參、刺五加配伍藥物對STZ 誘導高血糖小鼠血清SOD 活性和MDA 含量的影響(n=10， ± s)Table 4 Effect of P.ginseng and A.senticosus extract on serum SOD and the content of MDA in diabetic mice induced by STZ (n=10，± s)

4 討論

鏈脲佐菌素(STZ)是胰島β 細胞毒劑，對胰島β細胞具有選擇性破壞作用。它產生的自由基可直接損傷胰腺，破壞胰島β 細胞，降低體內胰島素水平從而造成血糖升高。除此之外，STZ 還會間接對其他器官組織造成不同程度的影響，例如使肝臟糖原合成以及葡糖糖轉運受到抑制，進一步加重血糖升高。長期處于高糖狀態下的小鼠由于氧化應激作用，導致其機體抗氧化防御體系失衡，血清MDA 含量升高，SOD 活性降低，引起胰島β 細胞損傷持續惡化。2 型糖尿病患者除了高血糖外，常表現為糖耐量異常、胰島素分泌下降，同時存在脂質代謝紊亂導致的體重減輕等。

人參作為我國特產名貴藥材之一，因其具有補脾益肺，益氣生津之效，故在我國傳統醫學中被用來治療消渴病。人參的有效成分以人參皂苷、人參揮發油、人參多糖、人參多肽、人參黃酮等活性成分為主，此外還含有氨基酸及大量的微量元素。人參莖葉中還含有山萘酚、三葉豆苷、人參黃酮苷等黃酮類化合物以及酚酸類、甾醇類成分［3］。動物試驗和臨床報導提示，人參皂苷、人參多糖、人參多肽有明顯的降血糖作用［4］。近年來對人參藥理作用的細致、深入研究表明其藥理作用十分廣泛。人參二醇總皂苷可顯著降低糖尿病大鼠血糖，改善血脂代謝紊亂，提高肝臟及外周組織胰島素敏感性，改善胰島素抵抗［5］;人參對STZ 誘導糖尿病大鼠具有明顯的降血糖、降血脂作用，表明人參具有改善糖尿病大鼠肝內糖代謝紊亂，增強肝細胞合成糖原的功能［6］;人參的降糖作用可能與促進脂肪細胞分化，增加胰島素敏感性和抑制基礎脂解有關［7］。

刺五加作為中藥，歷史悠久、應用廣泛，在歷代本草醫籍中均有記載。該藥具有扶正固本、補腎健脾、益智安神之功效。主治脾腎陽虛，腰膝酸軟，體恤乏力，失眠，多夢，食欲不振。近年來，國內外學者對刺五加的化學成分及其藥理作用進行了研究，從刺五加中分離得到大量的木脂素、三萜、香豆素、黃酮、多糖等多種活性成分。藥理作用研究表明，刺五加可增強機體非特異性防御能力，除具有免疫調節，抗腫瘤，抗衰老，抗輻射損傷，及抗疲勞等作用外，還可治療心腦血管疾病，糖尿病，精神衰弱等癥［8］;刺五加對四氧嘧啶誘導大鼠具有顯著降糖效果，通過對大鼠血糖、血脂和氧自由基代謝情況的觀察，發現刺五加還具有降血脂、改善氧自由基代謝紊亂的藥理活性，有助于糖尿病并發癥的防治［9］。

本實驗通過小鼠體重變化試驗數據得知，各組不同濃度乙醇提取的人參、刺五加配伍藥物能夠有效緩解糖尿病小鼠消瘦癥狀，對糖尿病小鼠體重下降具有一定的治療與恢復作用。STZ 誘導高血糖小鼠胰島素敏感性和糖耐量試驗發現，各組不同濃度乙醇提取的人參、刺五加配伍藥物均能改善機體對胰島素的敏感性，提高胰島素的生物利用度，同時可有效降低餐后血糖。小鼠血清SOD 活性和MDA 含量結果表明人參、刺五加配伍藥物能夠對抗自由基損傷，提高機體的抗氧化能力。通過STZ 誘導高血糖小鼠降血糖試驗，充分肯定了不同濃度乙醇提取的人參、刺五加配伍藥物對糖尿病模型動物的降糖作用，同時提示各組藥物均有緩解糖尿病臨床多飲、多尿癥狀的作用特點。但實驗發現，所得結果中以50%乙醇人參提取物與75%乙醇提取刺五加配伍后降糖效果最顯著，其次為75%、100%乙醇、水提取的人參與刺五加配伍藥物，這表明不同濃度乙醇提取部位所含有效降糖成分及含量有差異，以50%乙醇人參提取物與75%乙醇提取刺五加配伍所得有效降糖成分含量最高。雖然已有關于人參降糖活性的研究，但對于其具體的降糖成分目前并沒有詳細透徹的闡述，需進一步研究。本實驗研究提示，人參、刺五加配伍藥物對STZ 誘導高血糖小鼠的降糖作用可能是通過促進胰島素分泌，改善機體對胰島素的敏感性，提高機體的抗氧化能力等多方面共同作用的結果，但其具體的作用靶點及機制尚待進一步深入研究。

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