燈盞細(xì)辛提取物對(duì)2 型糖尿病小鼠氧化損傷的保護(hù)作用研究

王建勇，楊慶雄，黃小燕*

1貴州師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院;2 貴州師范大學(xué)化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院，貴陽(yáng) 550001

燈盞細(xì)辛［Erigeron breviscapus(Vant.)Hand.-Mazz.］是菊科(Compositae)飛蓬屬(Erigeron)植物，產(chǎn)于湖北、廣西、貴州、四川、云南及西藏等省區(qū)。臨床主要用于治療腦血栓形成、腦栓塞等［1，2］;本課題前期研究發(fā)現(xiàn)，燈盞細(xì)辛提取物具有改善2 型糖尿病模型動(dòng)物糖代謝，調(diào)節(jié)血脂等作用［3，4］，但具體機(jī)制尚不明確，本研究將從燈盞細(xì)辛提取物抗氧化以及對(duì)肝臟、胰腺損傷的保護(hù)作用，探討其改善糖代謝、調(diào)節(jié)血脂的相關(guān)機(jī)制。

1 材料與儀器

1.1 燈盞細(xì)辛提取物的制備

燈盞細(xì)辛，采自云南彌勒，由中國(guó)科學(xué)院昆明植物研究所楊崇仁研究員鑒定;干燥燈盞細(xì)辛藥材經(jīng)粉碎后，用70%乙醇熱回流提取三次，合并提取液，回收溶劑，得燈盞細(xì)辛總提取物?？偺崛∥锝?jīng)水乙酸乙酯萃取三次，合并乙酸乙酯回收溶劑得淺棕色粉末，總酚粉末經(jīng)大孔樹(shù)脂柱層析進(jìn)一步純化，得到供試藥粉末，冰箱保存?zhèn)溆茫瑢?shí)驗(yàn)時(shí)按要求配制相應(yīng)濃度藥液。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物

選取健康成年KM 種小鼠，體重18～20 g，雌雄各半，購(gòu)于第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號(hào):SCXK(渝)2001-0005。分籠飼養(yǎng)于貴州省貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院藥理教研室實(shí)驗(yàn)室。動(dòng)物適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。室溫18～28 ℃，相對(duì)濕度62%～80%。

1.3 主要試劑

高糖高脂飼料(蛋黃2.5%，蔗糖20%，豬油10%，基礎(chǔ)飼料67.5%);生理鹽水(重慶大新藥業(yè)股份有限公司，批號(hào):09082210);95%醫(yī)用酒精(貴州宏泰工貿(mào)保健品廠，批號(hào):09082305);四氧嘧啶(SIGMA 公司，批號(hào):L7424);鹽酸吡格列酮片(江蘇德源藥業(yè)有限公司，生產(chǎn)批號(hào):11110351);膽固醇測(cè)定試劑盒(批號(hào):BD1315)、甘油三酯測(cè)定試劑盒(批號(hào):BA1293，Siemens Healthcare Diagonstics Inc.);總超氧化物歧化酶(T-SOD 生產(chǎn)批號(hào):20120903)測(cè)定試劑盒、丙二醛(MDA 生產(chǎn)批號(hào):20120905)測(cè)定試劑盒:購(gòu)自南京建成生物工程研究所;其他試劑均為分析純。

1.4 主要儀器

UV-1800 型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)(日本島津有限公司);穩(wěn)豪血糖儀(強(qiáng)生公司);恒溫水浴鍋(天津市泰斯特儀器有限公司);電子天平(美國(guó)丹佛);TG16-W 微量高速臺(tái)式離心機(jī)(長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司);OLYMPUS 光學(xué)顯微鏡［日本奧林巴斯(中國(guó))有限公司］;MIAS-4400 顯微圖像分析系統(tǒng)(北京炳洋科技有限公司)等。

2 試驗(yàn)方法

2.1 動(dòng)物前期飼養(yǎng)及處理

，建立2 型糖尿病實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型［5］，試驗(yàn)期間，嚴(yán)格按照動(dòng)物飼養(yǎng)管理標(biāo)準(zhǔn)和規(guī)范進(jìn)行飼養(yǎng)。隨機(jī)選取出20 只小鼠喂普通飼料，自由飲水，其余小鼠喂高糖高脂飼料，自由飲水。喂養(yǎng)8 周后，兩組各隨機(jī)抽取4 只小鼠禁食不禁水12h，摘眼球取血，3000 rpm 離心5 min，取血清，進(jìn)行血脂檢測(cè)，喂高糖高脂飼料的小鼠血清中TC、TG 較對(duì)照組顯著升高(P＜0.01)，表明高脂動(dòng)物模型建模成功。取高脂模型小鼠禁食不禁水12 h，腹腔注射小劑量四氧嘧啶(180 mg/kg)。72 h 后，對(duì)小鼠進(jìn)行尾尖取血，用血糖儀檢測(cè)小鼠空腹血糖(檢測(cè)前12 h 禁食不禁水)，以血糖值≥10 mmol/L 為建立2 型糖尿病模型標(biāo)準(zhǔn)，篩選造模成功動(dòng)物。

2.2 動(dòng)物分組及處理

選取喂養(yǎng)普通飼料的小鼠10 只作為正常對(duì)照組;2 型糖尿病模型小鼠按血糖值隨機(jī)分成4 組，每組10 只，分別為模型組、燈盞細(xì)辛提取物高(200 mg/kg·d)、低劑量組(100 mg/kg·d)，吡格列酮(100 mg/kg·d)組，灌胃給藥，0.1 mL/10 g 體重，連續(xù)15 d。正常對(duì)照組給予等體積生理鹽水。除正常對(duì)照組外，其余各組繼續(xù)喂高糖高脂飼料。末次給藥1 h 后，小鼠眼球取血，3000 rpm 離心5 min，分離血清。取血后小鼠立即采用頸椎脫臼處死，取肝臟和胰腺組織，分別放于10%的福爾馬林中固定。

2.3 測(cè)定方法

嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書分別進(jìn)行測(cè)定，T-SOD酶活性測(cè)定采用黃嘌呤氧化酶法;MDA 濃度測(cè)定采用硫代巴比妥酸(TBA)法，檢測(cè)血清SOD 酶活性及MDA 濃度。病理切片采用常規(guī)HE 染色觀察，觀察胰腺外分泌部腺泡細(xì)胞和肝細(xì)胞變性及壞死，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，間質(zhì)水腫，血管反應(yīng)，纖維增生。上述病變占組織塊的30%以下1 分，占30%～50%之間2分，占50%以上3 分，將所有評(píng)分累加即胰腺和肝臟損傷的評(píng)分。

2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

數(shù)據(jù)用SPSS 16.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，所得統(tǒng)計(jì)結(jié)果均以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05作為顯著性差異，P＜0.01 作為極顯著性差異。

3 試驗(yàn)結(jié)果

3.1 燈盞細(xì)辛提取物對(duì)小鼠血清中T-SOD 活力和MDA 含量的影響

結(jié)果表明(表1)，模型組與正常組相比，血清中T-SOD 活力顯著降低(P＜0.01)，血清中MDA 含量顯著升高(P＜0.01);燈盞細(xì)辛提取物低劑量組與模型組相比，血清中T-SOD 活力顯著升高(P＜0.05)，血清中MDA 含量顯著降低(P＜0.01);燈盞細(xì)辛提取物高劑量組與模型組相比，血清中T-SOD活力顯著升高(P＜0.01)，血清中MDA 含量顯著降低(P＜0.01);其中燈盞細(xì)辛提取物高劑量組與燈盞細(xì)辛提取物低劑量組相比，對(duì)提高血清T-SOD 活力的作用效果差異不顯著(P＞0.05)，對(duì)降低血清中MDA 含量的作用效果差異也不顯著(P＞0.05)。由結(jié)果可以看出，燈盞細(xì)辛提取物能夠顯著提升2型糖尿病小鼠血清T-SOD 的活力，降低其血清中MDA 的含量，具有較強(qiáng)的體內(nèi)抗氧化活性。

表1 小鼠血清中總超氧化物歧化酶(T-SOD)活力及丙二醛(MDA)含量的測(cè)定結(jié)果Table 1 The T-SOD activities and MDA concentrations of mice serums in different groups

3.2 燈盞細(xì)辛提取物對(duì)2 型糖尿病模型小鼠胰腺、肝臟病理改變的影響

3.2.1 小鼠胰腺組織病理?yè)p傷評(píng)分

病理切片檢測(cè)表明，正常組小鼠胰腺組織中見(jiàn)個(gè)別腺泡細(xì)胞變性，其余腺泡細(xì)胞無(wú)變性壞死，偶見(jiàn)間質(zhì)血管充血及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，未見(jiàn)間質(zhì)水腫。與正常組相比，模型組小鼠胰腺組織中腺細(xì)胞變性、間質(zhì)血管充血、間質(zhì)水腫及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)部分非常明顯;與模型組相比，燈盞細(xì)辛高劑量組和燈盞細(xì)辛低劑量組小鼠胰腺組織中腺細(xì)胞變性、間質(zhì)血管充血、間質(zhì)水腫及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)部分明顯較少，通過(guò)組織病理?yè)p傷評(píng)分結(jié)果表明，燈盞細(xì)辛提取物對(duì)2 型糖尿病小鼠胰腺組織損傷具有一定的改善作用。評(píng)分結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 HE 觀察小鼠胰腺組織病理?yè)p傷評(píng)分(± s)Table 2 Scores of pathological damages of pancreas tissue of mice in different groups(± s)

表2 HE 觀察小鼠胰腺組織病理?yè)p傷評(píng)分(± s)Table 2 Scores of pathological damages of pancreas tissue of mice in different groups(± s)

3.2.2 小鼠肝臟組織病理?yè)p傷評(píng)分

病理切片檢測(cè)表明，正常組小鼠肝臟組織中見(jiàn)個(gè)別肝細(xì)胞變性，其余肝細(xì)胞無(wú)變性壞死，偶見(jiàn)間質(zhì)血管充血及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，未見(jiàn)間質(zhì)水腫。與正常組相比，模型組小鼠肝臟組織中肝細(xì)胞變性、間質(zhì)血管充血、間質(zhì)水腫及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)部分非常明顯;與模型組相比，燈盞細(xì)辛高劑量組和燈盞細(xì)辛低劑量組小鼠肝臟組織中肝細(xì)胞變性、間質(zhì)血管充血、間質(zhì)水腫及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)部分明顯較少，通過(guò)組織病理?yè)p傷評(píng)分結(jié)果表明，燈盞細(xì)辛提取物對(duì)2 型糖尿病小鼠肝臟組織損傷具有一定的改善作用。評(píng)分結(jié)果見(jiàn)表3。

4 討論

圖1 胰腺組織病理切片(400X)Fig.1 Pathological sections of pancreas tissues (400X)

表3 HE 觀察小鼠肝臟組織病理?yè)p傷評(píng)分(± s)Table 3 The scores of pathological damage of liver tissue of mice in different groups(± s)

表3 HE 觀察小鼠肝臟組織病理?yè)p傷評(píng)分(± s)Table 3 The scores of pathological damage of liver tissue of mice in different groups(± s)

圖2 肝臟組織病理切片(400X)Fig.2 Pathological sections of liver tissues (400X)

大量動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床研究證明，患糖尿病時(shí)存在著明顯的氧化應(yīng)激效應(yīng)［6］，糖尿病活性氧增多的確切機(jī)制尚未完全闡明，可能的原因:升高的血糖和糖化血紅蛋白自氧化使自由基的產(chǎn)生增加，機(jī)體抗氧化系統(tǒng)清除自由基的能力減弱，葡萄糖自氧化產(chǎn)生的醛基進(jìn)一步氧化修飾蛋白質(zhì)，導(dǎo)致蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能改變而參與氧化應(yīng)激［7］。正常機(jī)體內(nèi)自由基代謝維持動(dòng)態(tài)平衡，是由于存在有效的自由基清除系統(tǒng)。動(dòng)物體內(nèi)源性自由基清除系統(tǒng)包括酶和非酶抗氧化系統(tǒng)。SOD 是生物酶系統(tǒng)抗氧化劑，MDA是氧自由基引起的脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)所產(chǎn)生的脂質(zhì)過(guò)氧化物在機(jī)體內(nèi)的代謝終產(chǎn)物，能夠間接地反映機(jī)體內(nèi)氧自由基代謝狀況、機(jī)體組織細(xì)胞受自由基攻擊的程度及脂質(zhì)過(guò)氧化程度［8］。由本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，燈盞細(xì)辛提取物能夠顯著提升2 型糖尿病小鼠血清T-SOD 的活力，降低其血清中MDA 的含量，能夠有效清除體內(nèi)活性氧自由基和脂質(zhì)過(guò)氧化物，保護(hù)機(jī)體免受自由基的損傷。

研究發(fā)現(xiàn)，2 型糖尿病發(fā)生中，常同時(shí)存在脂代謝紊亂，超過(guò)一半的2 型糖尿病患者合并脂代謝紊亂，造成脂肪酸在胰島內(nèi)沉積，導(dǎo)致胰島細(xì)胞的“脂毒性”和“脂凋亡”，繼而引起胰島功能衰竭［9］。肝臟有大量胰島素受體，肝臟得不到滋養(yǎng)時(shí)，必然會(huì)使代謝產(chǎn)生的有害物質(zhì)積聚，進(jìn)一步損傷肝細(xì)胞線粒體，使其能量供應(yīng)受損，核糖體合成蛋白質(zhì)的活性下降，肝臟合成蛋白質(zhì)的能力減弱。而肝臟、胰腺的損傷又進(jìn)一步加劇了血糖及脂肪代謝的紊亂。本研究表明，燈盞細(xì)辛提取物對(duì)2 型糖尿病小鼠胰臟、肝臟組織損傷具有一定的改善作用，可以減輕模型動(dòng)物肝臟及胰腺組織炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)及變性、水腫等。

綜上研究結(jié)果，燈盞細(xì)辛提取物能夠改善血糖代謝以及血脂代謝與其有效清除體內(nèi)活性氧自由基和脂質(zhì)過(guò)氧化物以及對(duì)肝臟和胰腺的保護(hù)作用有關(guān)。

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