響應(yīng)面法優(yōu)化康定鼠尾草中迷迭香酸提取工藝

遲曉峰，董 琦，胡風(fēng)祖

中國(guó)科學(xué)院西北高原生物研究所 中國(guó)科學(xué)院藏藥研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西寧 810008

康定鼠尾草(Salvia prattiiHemsl.)為唇形科鼠尾草屬植物，產(chǎn)四川西部、西北部、青海省南部;分布于海拔3750～4000 m 的山坡草地上［1］。迷迭香酸(rosmarinic acid，Ros A 分子式C18H16O8)是由一份子咖啡酸和一分子3，4-二羥基苯基乳酸(即丹參素)的縮合物，為有活性的水溶性的多酚類化合物。迷迭香酸具極強(qiáng)的清除體內(nèi)自由基的活性和抗氧化作用［2］;抗血栓作用［3］;以及抑制HIV-1 逆轉(zhuǎn)錄酶的活性［4］。初步實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，康定鼠尾草中迷迭香酸含量較高，有較大開發(fā)利用價(jià)值，因此，本實(shí)驗(yàn)采用響應(yīng)面分析法對(duì)主要因素進(jìn)行優(yōu)化，確定較優(yōu)的提取工藝方法，為大批量生產(chǎn)提供科學(xué)的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

康定鼠尾草根采自青海省玉樹自治州，經(jīng)中國(guó)科學(xué)院西北高原生物研究所陳世龍研究員鑒定為唇形科植物康定鼠尾草(Salvia prattiiHemsl.)。迷迭香酸對(duì)照品由上海同田生物技術(shù)有限公司提供，甲醇為色譜純和優(yōu)級(jí)純，H3PO4、無(wú)水乙醇，均為分析純。

美國(guó)Waters 515 型高效液相色譜儀:二元梯度泵，Waters 2996 紫外檢測(cè)器，EMPOWER 色譜工作站;KQ-100E 型超聲波清洗器(昆山超聲儀器科技有限公司);MOLELEMENT 元素型超純水機(jī)(上海摩勒生物科技有限公司)。

1.2 迷迭香酸的測(cè)定

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱取迷迭香酸標(biāo)準(zhǔn)品2.29 mg，用甲醇溶解，定容于10 mL 的容量瓶，其質(zhì)量濃度為0.229 mg/mL。

1.2.2 色譜條件

LiChrospher Cl8柱(4.6 mm ×250 mm i.d.，5 μm);流動(dòng)相:甲醇:水(0.1% H3PO4)=40∶60;紫外檢測(cè)波長(zhǎng):330 nm;流速:1 mL/min;進(jìn)樣量:10 μL，柱溫:30 ℃。

1.2.3 樣品測(cè)定

分別制備不同的康定鼠尾草供試品，精密吸取10 μL 注入液相色譜儀，測(cè)定樣品中迷迭香酸的含量，樣品和對(duì)照品的HPLC 色譜圖見圖1。

圖1 樣品與對(duì)照品色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of reference substance and samples

1.3 單因素實(shí)驗(yàn)

在進(jìn)行響應(yīng)面分析之前，先通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)選出對(duì)康定鼠尾草中迷迭香酸提取得率具有顯著影響的因素，并確定其實(shí)驗(yàn)水平。本文考察不同乙醇濃度、液料比、提取時(shí)間和提取次數(shù)對(duì)康定鼠尾草中迷迭香酸提取得率的影響。

2 結(jié)果與討論

2.1 迷迭香酸測(cè)定方法學(xué)考察

2.1.1 精密度實(shí)驗(yàn)

準(zhǔn)確吸取混合標(biāo)準(zhǔn)溶液10 μL 重復(fù)進(jìn)樣5 次，測(cè)得各標(biāo)準(zhǔn)峰面積，計(jì)算RSD 值為:0.93%。實(shí)驗(yàn)表明，在該條件下精密度良好。

2.1.2 重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)

精密吸取同一批樣品溶液，進(jìn)樣6 次，測(cè)定樣品中迷迭香酸的量。測(cè)得各峰面積，計(jì)算RSD 值為:1.19%。實(shí)驗(yàn)表明，迷迭香酸的測(cè)定結(jié)果重現(xiàn)性良好。

2.1.3 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取同一批供試品溶液，按含量測(cè)定法分別在0、4、8、12、24 h 進(jìn)樣，測(cè)定樣品中迷迭香酸的含量。測(cè)定各目的峰面積，計(jì)算RSD 為:0.87%。實(shí)驗(yàn)表明，供試品溶液24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.4 回收率實(shí)驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取0.500 g 的樣品9 份，取1.2.1 述標(biāo)準(zhǔn)溶液依次加50、100、150 μL 于每3 份樣品中，按樣品的測(cè)定方法提取及測(cè)定。以9 次測(cè)定的平均值計(jì)算回收率分別為:100.3%，RSD 為1.9%。

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 乙醇濃度對(duì)迷迭香酸提取得率的影響

設(shè)定液料比15∶1、超聲60 min、溫度20 ℃、提取次數(shù)為兩次的條件下，不同乙醇濃度對(duì)迷迭香酸得率的影響。結(jié)果表明隨著乙醇濃度的提高，迷迭香酸得率呈上升趨勢(shì)，當(dāng)乙醇濃度達(dá)到40%時(shí)迷迭香酸得率最大，之后隨著濃度的增加，得率反而降低。因此選擇40%左右乙醇濃度作為較佳的提取溶劑。

2.2.2 液料比對(duì)迷迭香酸提取得率的影響

設(shè)定乙醇濃度40%、超聲60 min、溫度20 ℃、提取次數(shù)為兩次的條件下，不同液料比對(duì)迷迭香酸得率的影響。結(jié)果表明，迷迭香酸得率隨著溶劑量的增加而增加，這是由于溶劑用量增加，藥材與溶劑接觸面增加，有利于擴(kuò)散速度的提高。在液料比達(dá)到15∶1 后，迷迭香酸含量提取得率基本保持不變。由此確定迷迭香酸提取的液料比以15∶1 為宜。

2.2.3 提取時(shí)間對(duì)迷迭香酸提取得率的影響

設(shè)定乙醇濃度40%、液料比15∶1、溫度20 ℃、提取次數(shù)為兩次的條件下，不同超聲時(shí)間對(duì)迷迭香酸得率的影響。結(jié)果表明，超聲10～50 min 內(nèi)迷迭香酸得率呈上升趨勢(shì)，然后隨時(shí)間的延長(zhǎng)含量基本不變。由Fick 擴(kuò)散定律可知得率與提取時(shí)間呈正比，在一定條件下，超聲時(shí)間越長(zhǎng)得率越高;但時(shí)間太長(zhǎng)會(huì)使擴(kuò)散次數(shù)降低，反而影響迷迭香酸的得率，因此，本實(shí)驗(yàn)選擇超聲時(shí)間為50 min。

2.2.4 提取次數(shù)對(duì)迷迭香酸提取得率的影響

設(shè)定乙醇濃度40%、液料比為15 ∶1、超聲60 min、溫度20 ℃的條件下，不同提取次數(shù)對(duì)迷迭香酸得率的影響。結(jié)果表明，提取兩次后，迷迭香酸含量提取得率基本保持不變。由此確定迷迭香酸提取的次數(shù)以兩次為宜。

2.3 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)及其結(jié)果

2.3.1 響應(yīng)面方案設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素初篩試驗(yàn)結(jié)果，分別確定乙醇濃度、液料比、提取時(shí)間為因素，每個(gè)因素三個(gè)水平進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，因素水平表見表1。

表1 Box-Behnken 因素及水平安排表Table 1 Factors and levels of Box-Behnken design

2.3.2 響應(yīng)面分析結(jié)果

取康定鼠尾草干燥根，精密稱定，由Box-Behnken 設(shè)計(jì)方案所得的試驗(yàn)條件進(jìn)行試驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。

采用Design-Expert7.0 軟件對(duì)表2 結(jié)果進(jìn)行響應(yīng)面回歸分析，得擬合方程 Y=-77.77817 +0.75745 × X1+0.38609 × X2+1.49770 × X3-0.00075875 × X1 × X2+0.0008375 × X1 × X3-0.0016125 ×X2 ×X3-0.00777042 ×X12-0.00122385×X22-0.094698 ×X32，對(duì)該方程的回歸分析和方差如表3 所示。

由表3 可以看出，方程的因變量和自變量之間線性關(guān)系明顯，該模型和失擬項(xiàng)均顯著，并且該模型的R2=0.9897，表明該二次回歸得到的迷迭香酸提取率模型與實(shí)際擬合較好，符合度為98.97%，表明使用該方程模擬實(shí)際的三因素三水平的分析是可行的。同時(shí)由F 值得大小可以推斷，在所選擇的實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)，3 個(gè)因素對(duì)迷迭香酸提取率影響的排列順序?yàn)?乙醇濃度(X3)＞提取時(shí)間(X2)＞料液比(X1)

表2 Box-Behnken 設(shè)計(jì)方案及響應(yīng)值Table 2 Box-Behnken design and response values

表3 回歸方程方差分析Table 3 Analysis of variance of regression equation

圖2 時(shí)間和料液比對(duì)迷迭香酸得率的影響Fig.2 Response surface plot showing the effects of extraction time and solid-liquid ratio on extraction yield of rosmarinic acid

圖3 時(shí)間和乙醇濃度對(duì)迷迭香酸得率的影響Fig.3 Response surface plot showing the effects of extraction time and ethanol concentraion on extraction yield of rosmarinic acid

圖4 料液比和乙醇濃度對(duì)迷迭香酸得率的影響Fig.4 Response surface plot showing the effects of solid-liquid ratio and ethanol concentration on extraction yield of rosmarinic acid

響應(yīng)面圖形是響應(yīng)值對(duì)各因素(X1、X2、X3)所構(gòu)成的三維空間的曲面圖，從圖2～4 上可形象地看出各因素交互作用對(duì)響應(yīng)值的影響。比較圖2～4可知，乙醇濃度數(shù)對(duì)迷迭香酸得率的影響最為顯著，表現(xiàn)為曲線較陡，乙醇濃度最佳值在40%左右;而時(shí)間和料液比次之，表現(xiàn)為曲線較為平滑，其最佳響應(yīng)值分別在50 min 和15∶1 左右。

2.4 最優(yōu)條件的確定

通過(guò)回歸模型預(yù)測(cè)的迷迭香酸提取的最佳工藝條件為:乙醇濃度38.44%，液固比15.56∶1，時(shí)間50.57 min，在此條件下，迷迭香酸理論上可達(dá)12.37 mg/g。

考慮到實(shí)際操作的可行性，將迷迭香酸的提取條件在回歸方程得到的理論值基礎(chǔ)上修正為∶乙醇濃度40%，液固比15∶1，提取時(shí)間50 min。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)以康定鼠尾草根為原料，對(duì)迷迭香酸進(jìn)行了超聲提取工藝的研究。采用響應(yīng)面分析法對(duì)乙醇濃度、液固比、超聲時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化，確定提取溶液為40%乙醇、液固比15∶1、提取50 min，在此條件下迷迭香酸提取效果最佳，迷迭香酸得率可達(dá)12.30 mg/g。通過(guò)該提取工藝的研究，為工業(yè)生產(chǎn)迷迭香酸提取物提供科學(xué)的參考依據(jù)。

1 Flora of China，Chinese Academy of Sciences Editorial Commission(中國(guó)科學(xué)院中國(guó)植物志編委會(huì)).Flora of China(中國(guó)植物志).Beijing:Science Press，1977.Vol 66，70-71.

2 Huang ZS(黃治森)，Zhang JT (張均田).Antioxidant properties of three water-solubility components fromSalvia miltiorrhiza.Acta Pham Sin(藥學(xué)學(xué)報(bào))，1992，27:96-100.

3 Petersen M，Simmonds MS.Rosmarinic acid.Phytochemistry，2003，62:121-125.

4 Hooker CW，Lott WB，Harrich D.Inhibitors of human immuno-deficiency virus type 1 reverse transcriptase target distinct phases of early reverse transcription.J Virol，2001，75:3095-3104.