溶血及宮頸黏液對人乳頭狀瘤病毒DNA檢測結果的影響

謝秋華 有 軍

浦東新區公利醫院檢驗科，上海 200135

人類乳頭狀瘤病毒（human papillomavirus，HPV）感染是導致宮頸癌及癌前病變的主要因素[5，7]。目前Real-time PCR 技術廣泛被實驗室用于檢測HPV 感染[4，6，8]，用于檢測HPV 的宮頸脫落細胞樣本，即使嚴格按照采樣規范進行樣本采集，但收集到的樣本仍不可避免地混有血液或宮頸黏液。本研究通過對含不同濃度血紅蛋白（hemoglobin，Hb）或宮頸黏液的宮頸脫落細胞樣本，采用Real-time PCR 法進行檢測，探討溶血及宮頸黏液對HPV DNA檢測結果的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2012年9月—2013年5月內本院婦科門診就診的女性患者宮頸脫落細胞標本作為研究對象。選取其中HPV 檢測為陽性的標本進行研究，患者年齡19～53歲，平均年齡（34.3±8.2）歲，其中隨機抽取10例未溶血且不含宮頸黏液的陽性樣本作為溶血組初始樣進行試驗，10例未溶血而富含宮頸黏液的陽性樣本作為黏液組初始樣本進行試驗。

1.2 儀器與試劑

PCR 反應擴增儀為ROCHE Lightcycler1.2;核酸的抽提、擴增及檢測試劑購自港龍生物技術（深圳）有限公司。

1.3 樣本采集和分組

所有樣本均經被采集本人知情同意，嚴格按照宮頸脫落細胞樣本采集規范采集，采集后樣本盡快送檢，4℃保存不超過1 d，-20℃保存不超過6 個月。溶血試驗組樣本為未溶血且不含宮頸黏液的陽性樣本，黏液組試驗樣本為未溶血而富含宮頸黏液的陽性樣本。

1.4 溶血樣本的制備

取本實驗室收到的多個宮頸脫落細胞重度溶血樣本，檢測其Hb 濃度以確定所制備溶血樣本的Hb 濃度范圍，檢測得到Hb 濃度＜5 g/L，故溶血樣本Hb 濃度取5 g/L 和10 g/L。

取一份女性健康體檢的志愿者EDTA-K2 抗凝的“O”型全血樣本4 mL，加入15 mL 離心管，2000 g 離心5 min 后吸棄血漿，加入10 mL 無菌生理鹽水并震蕩混勻，2000 g 離心5 min 后去上清，重復洗滌2 次。加入2 mL 無菌生理鹽水懸浮紅細胞，測定懸液Hb 濃度，然后用無菌生理鹽水稀釋成相應度濃度的紅細胞懸液，-30 ℃與常溫10 min 凍融1 次，制成含部分未裂解紅細胞的Hb 懸液。

取初始樣本500 μL/份1:1 加入Hb 懸液并混勻，得到Hb 終濃度不同而HPV 含量相同的模擬溶血樣本。未溶血組為500μL 初始樣本加500 μL 無菌生理鹽水（Hb 為0 g/L），溶血組為500 μL初始樣本加入500 μL Hb 懸液，Hb 終濃度分別為5 g/L 和10 g/L。

1.5 宮頸黏液樣本的處理

樣本分為黏液未處理組、凍融解黏組和NaOH 解黏組進行檢測。黏液未處理組組取500 μL 初始樣本；凍融解黏組取初始樣本500 μL 經凍融解黏處理；NaOH 解黏組取500 μL 初始樣本加入500 μL NaOH（0.1 mol/L）進行處理。

1.6 HPV DNA 檢測步驟

主要檢測步驟包括HPV DNA 提取，PCR 擴增檢測，每一步均嚴格按照試劑說明書進行操作。

1.7 結果判斷

以PCR 擴增檢測得到的HPV DNACt 值進行判斷：無數值報高危型HPV 陰性；Ct 值小于37 報高危型HPV 陽性；Ct 值在37～40 之間，復檢；重新檢測結果Ct 值＜40 報高危型HPV 陽性，無Ct 值報高危型HPV 陰性。

1.8 統計學處理

統計學處理采用SAS 8.0 軟件包進行統計學分析：定量資料采用（）表示，行隨機區組的方差分析，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 溶血對HPV DNA 擴增Ct 值結果的影響

為了觀察溶血對HPV DNA 擴增Ct 值結果的影響，在初始樣本中分別加入生理鹽水和Hb 懸液，制成Hb 終濃度為0、5、10 g/L的溶血樣本。結果發現，隨著Hb 濃度由0 g/L 增加至10 g/L，三組對HPV DNA 擴增檢測Ct 值結果的差異無統計學意義（F=0.96，P=0.4019），見表1。

表1 溶血對HPV DNA 擴增Ct 值的影響

2.2 宮頸黏液對HPV DNA 擴增Ct 值結果的影響

為了觀察宮頸黏液對HPV DNA 擴增Ct 值結果的影響，按是否進行解黏處理分為黏液未處理組、凍融解黏組和NaOH 解黏組進行檢測。結果發現，三組間Ct 值結果差異有統計學意義（F=46.28，P＜0.0001）；其中凍融解黏組和NaOH 解黏組Ct 值結果與黏液未處理組相比，Ct 值結果減小，差異有統計學意義（P＜0.05），而凍融解黏組與NaOH 解黏組相比，Ct 值的差異無統計學意義（P ＞0.05），見表2。

表2 宮頸黏液對HPV DNA 擴增Ct 值的影響

3 討論

目前HPV DNA 檢測被廣泛應用于臨床檢測，而檢測結果的準確性往往與病毒核酸的提取及樣本的性質密切相關。在樣本采集過程中盡管已嚴格按照操作規程如避開婦女的月經期等，但在某些情況下采集到的樣本依然不可避免地出現混有血液或者宮頸黏液等現象。本研究通過Real-time PCR 技術對宮頸脫落細胞樣本進行HPV DNA 檢測，結果發現，溶血對結果不產生影響，宮頸黏液經凍融或NaOH 解黏化處理后能減少黏液對檢測的干擾，降低復檢率。

Hb 中的血紅素可抑制DNA 聚合酶的活性，降低熒光定量PCR 檢測結果，甚至出現假陰性[3]。伍金華等[2]研究發現，在用導流雜交基因芯片技術檢測人乳頭狀瘤病毒分型過程中，Hb 對該檢測結果沒有影響。在本研究中，當Hb 終濃度分別為0、5、10 g/L時，HPV DNA 的Ct 值的變化不大，結果表明檢測Hb 亦不結果影響Real-time PCR 技術對宮頸脫落細胞樣本的HPV DNA 檢測。

宮頸黏液的多少與婦女生理性周期性的變化或病理變化相關，采樣過程中并不能完全杜絕樣本帶有黏液情況的出現。陳鳳等[1]研究顯示，第2 代雜交捕獲法檢測HPV DNA，其檢測結果不受樣本帶有分泌物的影響，而伍金華等[2]研究發現，在導流雜交基因芯片技術檢測人乳頭狀瘤病毒時，有黏液組標本復檢率高于無黏液組。因DNA 相對耐堿且宮頸黏液樣本-30℃凍存一定時間后復融會發生解黏現象，本研究中對宮頸黏液進行凍融或NaOH 處理以達到解黏目的。檢測結果發現，與黏液未處理組相比，凍融解黏組、NaOH 解黏組Ct 值結果減小（P＜0.05），表明解黏有助于HPV DNA 的檢測。本研究所中對含宮頸黏液樣本的經凍融或加NaOH 進行解黏處理后，需復檢的樣本數由3/10 降為0/10，降低了樣本的復檢率。探討其原因有①樣本吸樣及離心后去上清過程中受到宮頸黏液特影響，可能造成上皮細胞的丟失或稀釋，進而影響檢測結果。②抽提過程中，樣本中含有的黏液使上皮細胞未能充分裂解并釋放病毒，從而影響抽提效果。③黏液樣本中可能含有較多的內源性抑制物如黏蛋白、免疫球蛋白和蛋白酶等，可能干擾核酸提取或者抑制聚合酶活性。

綜上所述，Real-time PCR 法檢測HPV DNA 時，溶血與否不影響該方法對宮頸脫落細胞樣本HPV DNA 的檢測結果；對宮頸黏液進行凍融或NaOH 解黏處理后可有效清除黏液對檢測的干擾，降低復檢率。對于宮頸黏液合并溶血的樣本是否對檢測結果有影響，尚待進一步研究。

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