蛇足石杉離體培養產生有效成分的研究

吉枝單，涂藝聲，丁明華，陳 雄，蔣秀芳

江西師范大學 功能有機小分子教育部重點實驗室，南昌 330022

蛇足石杉(Huperzia serrata (Thunb)Trev)又名千層塔、蛇足石松、蛇足草等，為石杉科石杉屬蕨類植物，全草具有解毒、止痛、散瘀消腫功效［1］。自1972 年中國科學院上海藥物研究所首次報道蛇足石杉植物中的生物堿石杉堿甲(Huperzine A，HupA)在動物實驗上有松弛橫紋肌的作用之后，已從中分得十幾個生物堿單體［2］，研究證明其中的HupA 是一種強效、可逆和高選擇性乙酰膽堿酯酶抑制劑。低劑量HupA 對乙酰膽堿酯酶(Ach E)有強大的抑制作用，并對阿爾茨海默癥(Alzheimer’s disease，AD)和重癥肌無力有良好的治療效果及有提高學習記憶力的功效［3］。隨著老齡化社會的到來，阿爾茨海默癥暨老年癡呆癥已成為人類的第四大病魔。據臨床試驗，石杉堿甲Hup-A)制劑是目前國內外成功治療老年性癡呆癥的候選藥物。因化學合成的相應成分取替天然石杉堿甲還有一定距離［4，5］，而野生蛇足石杉生長緩慢，8 年左右的成熟株高僅20～30 cm，人工大面積栽培尚難實現，加上因利益驅動所致的對野生資源的肆意采挖，致使蛇足石杉自然資源嚴重匱乏。利用現代生物工程生產天然石杉堿甲是解決該稀缺資源的新途徑［6，7］。國內胡之璧先生實驗室報道，從蛇足石杉內生真菌中篩選到2 株內生真菌2F09P03B 和LQ2F01 具有能夠累積結構不同而都具有抗乙酰膽堿酯酶活性的表現，取得了令人興奮的成果。目前，蛇足石杉莖段離體培養再生葉狀體產生石杉堿甲成分的研究報道鮮見，本研究為解決天然石杉堿甲資源匱乏找到了一條從葉狀體離體培養獲得之路，系植物器官工程生產植物源石杉堿甲的突破。

1 材料

1.1 植物材料

取自廬山多年生的野生蛇足石杉植株，由中國科學院廬山植物園詹遠懷研究員鑒定提供。

1.2 主要試劑和儀器

石杉堿甲(Huperzine A，HupA)標準品購自上海源葉生物科技有限公司(批號:20110111)，KQ3200DE 型數控超聲波清洗儀;TLC 板為青島海洋化工有限公司生產的硅膠G 板;Waters 2996 高效液相色譜儀。

2 方法

2.1 葉狀體的誘導

實驗采用上述蛇足石杉植株秋季的半木質嫩莖。仔細將嫩莖清洗干凈、表面消毒，在無菌條件下，將葉片切割成5 mm×5 mm 或莖切割成5 mm 左右長，接種到準備好的的誘導培養基中:①MS［8］;②MS+IAA0.5 mg/L;③1/2 MS+IAA0.5 mg/L;④1/4 MS+IAA0.5 mg/L;⑤6，7-V［9］+IAA0.5 mg/L。每瓶接種5 塊，每個處理重復4 次。

2.2 葉狀體的增殖培養

取誘導產生的葉狀體分割成小塊進行增殖培養條件優化。增殖培養基以MS 或1/2MS 或6，7-V 為基本培養基，添加不同濃度生長素IAA(0.1 mg/L～1.5 mg/L)、NAA、2，4-D 或IAA 與ZT 配合、不加任何激素的基本培養基(MS、1/2MS、B5、6，7-V)、蔗糖用量處理(g/L):10、15、20、25、30。每瓶接種約1 g，各種處理重復4 次，各培養基的pH 調至約5.8～6.2;培養在溫度(24 ±2)℃，每日光照14 h，光照強度1500 lx 左右。

2.3 培養物增殖量的測定計算

采取相對增長百分率進行對比，這樣可以消除因接種量的多少而產生的誤差。

相對增長百分率=(收獲量-接種量)/接種量×100%，每代生長期55 d。

2.4 培養物中生物堿的提取

參考王峻等［10］的方法作適當修改。葉狀體收獲后在60 ℃下烘干至恒重，用研缽研成粉末后，精確稱取粉末1.0 g 于試管中，加入10 mL 2%酒石酸溶液，密封，浸提10～15 h，然后在70 MHz 下55 ℃超聲1.5 h，濾出上清液;濾液加氨水調pH 至9～10，加入等體積氯仿，充分搖勻萃取，靜置30 min 待分層，重復3 次，合并氯仿層蒸發至干，加入適量甲醇溶解得生物堿提取液，用作TLC 點樣及高效液相檢測。

2.5 培養物中石杉堿甲定性檢測

薄層層析(TLC)檢測:參照周漢華等［11］方法有所改進，展開劑3 個:氯仿/丙酮/異丙醇(4∶4∶2，v/v/v)、氯仿/丙酮/異丙醇/氨水(4∶4∶2∶0.1，v/v/v/v)、氯仿-甲醇-氨水(6 ∶1 ∶0.1，v/v/v);顯色劑:0.2%高錳酸鉀溶液。將點樣的硅膠板置于預先飽和的展開劑中，待展開液離層析板另一端1 cm 處取出層析板，顯色后測其Rf 值。

2.6 培養物中石杉堿甲HPLC 檢測

參照王珊等［12］檢測方法。色譜柱:Waters C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm);流動相:甲醇-醋酸銨(0.08 mol/L;pH=6)=3∶7;流速:0.8 mL/min;檢測波長:308 nm;柱溫:25 ℃;進樣量:15 μL。

3 結果與分析

3.1 不同培養基組分對蛇足石杉外植體啟動葉狀體發生的差異

為了建立蛇足石杉組織培養繁殖系，筆者選擇了不同的基本培養基、不同的養分濃度及添加生長素誘導處理外植體。實驗結果表現，60 d 后有的培養基上分化出簇生葉狀體見圖1，70 d 統計結果見表1。外植體在較低養分濃度的培養基③、④、⑤上應答啟動誘導率較高，蛇足石杉葉狀體誘導率在40%～50%，而培養基①、②誘導率低;對比培養基⑤與②、③、④，有明顯差異;說明蛇足石杉離體培養的啟動要求適宜的基質配方，添加生長素能提高葉狀體的誘導率。

3.2 外源激素對葉狀體繼代增殖的影響

在已建立的無菌離體葉狀體基礎上，為了探索葉狀體繼代增殖培養基中激素的作用，設計了多因素隨機對比試驗，結果見表2。

表1 不同培養基配方誘導蛇足石杉試管葉狀體的啟動Table 1 Thallus induction of Huperzia serrata (Thunb.)Trev.in different culture medium

表2 激素對蛇足石杉試管葉狀體繼代增殖的效果Table 2 The effects of different media homen on growth of H.serrata thallus

表3 方差分析Table 3 Analysis of variance

由表3 不同激素不同濃度誘導葉狀體的增殖的方差分析中P ＜0.01，可以看出不同的培養基配方的作用極顯著。從表2 Duncan 各處理間平均數看出，不加任何激素的培養基A，平均相對增長率最高，增長率達到了10 倍左右。葉狀體在添加生長素2，4-D、NAA、IAA(0.1～1.0)mg/L 的不同濃度培養基上相對增長率均低于未添加激素的培養基A，說明外源激素對蛇足石杉離體葉狀體增殖具有明顯的抑制作用。

3.3 蔗糖用量對葉狀體繼代增殖的作用

在誘導外植體發生葉狀體階段，發現完全MS培養基的效果比1/2MS、1/4MS 以及6，7-V［10］誘導率低。但葉狀體的繼代增殖是脫離了外植體的組織器官增殖，為了探索其中主要碳源蔗糖的使用量，筆者設計了不同培養基質及蔗糖用量的多因素隨機試驗，培養55d 統計各處理生物量鮮重，換算相對增殖率以消除接種差異。結果見表4，葉狀體在原始配方6，7-V、1/2MS、MS 培養基中培養，最適的培養基是6，7-V。

表4 不同基質與蔗糖用量對蛇足石杉試管葉狀體繼代增殖的差異Table 4 The effects of different media and used on growth of H.serrata thallus

表5 方差分析Table 5 Analysis of variance

由表5 葉狀體相對增殖率的方差分析中P ＜0.01，可以看出不同培養基種類的方差達到極顯著。由表4 Duncan 法分析各處理平均數可以看出，在MS 基本培養基里加入20 g/L 蔗糖時，葉狀體相對增殖率最高，平均為1362.6%。當培養基中蔗糖用量30 g/L 時，明顯不利于葉狀體的生長增殖。對比各處理，蔗糖用量以20 g/L 的MS 顯著優于其他處理，表現更適宜葉狀體的生長增殖，同時也說明養分濃度與碳源的合適搭配能獲得更好的生物量。

3.4 葉狀體培養物中累積石杉堿甲的TLC

采取TLC 檢測不同培養基中培養的葉狀體抽提物，以石杉堿甲標準品和接種的母株干粉抽提物為對照TLC 檢測，試驗了不同的展開劑效果，篩選出氯仿/丙酮/異丙醇/氨水(4∶4∶2∶0.1，v/v/v/v)層析效果好，測得石杉堿甲標準品Rf=0.39，接種的母株和不同培養基中培養的葉狀體的抽提物中均出現與標準品相同的顯色斑點Rf=0.39，見圖2。證明培養物中能產生與接種母株含有的相同石杉堿甲成分，即存在與石杉堿甲標準品相同的成分。說明本研究獲得的葉狀體具有產生蛇足石杉有效成分石杉堿甲的能力。

圖1 蛇足石杉原植物及其離體培養誘導培養葉狀體過程Fig.1 H.serrata in wild and the progress of the thallus induction in vitro culture

圖2 蛇足石杉離體葉狀體提取物與石杉堿甲標準品、原植株提取物對照的TLCFig.2 The TLC test of extract of the wild H.serrata and thallus in vitro culture，Huperzine A standard

3.5 葉狀體培養物中累積石杉堿甲的HPLC

在色譜條件下檢測的圖3，其中D 石杉堿甲標準品的出峰時間為10 min 左右，最大吸收波長為308 nm。以1、2、3 μg/mL 標準品的濃度為橫坐標，面積為縱坐標，測得的線性關系為y=149987x-87338，r=0.9957;E 為培養物樣品HPLC 色譜圖，相同條件下10 min 左右有一個吸收峰，亦說明了石杉堿甲在培養物中累積，E 和D 說明樣品中異型結構分子復雜多樣，可預知Huperzine A 的培養調控具較大的潛力。

圖3 蛇足石杉離體葉狀體培養物提取物及石杉堿甲標品的HPLCFig.3 The HPLC test of extract of thallus in vitro culture and Huperzine A standard

4 討論

國內有多個實驗室開展了蛇足石杉的組織培養，但蛇足石杉組織培養再生葉狀體僅筆者實驗室成功。沈曉霞等人對千層塔莖尖組織培養滅菌方法的研究，經過多種滅菌方法的摸索和比較，發現千層塔莖尖外植體的滅菌十分困難，并且外植體在光照培養4～5 d 后都發白死亡，無法繼續培養。只有在暗培養的條件下，莖外植體才保持嫩綠，在含有5 mg/L 2，4-D 和1 mg/L KT 的MS 基本培養基上培養誘導，2 個月后長出褐色的愈傷組織，以后停止生長［13］。周穎等人報道蛇足石杉莖尖組織培養過程中，雖然已經采取多種滅菌措施，仍然會被污染［14］。楊雪飛等采用表面滅菌和內生菌殺滅相結合的方法使外植體的無菌率達到52%，但分化率較低［15］。孫玉強等離體培養千層塔外植體建立了愈傷組織，但生長速度慢［16］。總結蛇足石杉莖外植體的組織培養的突出問題是:①外植體消毒困難;②再分化率低;③培養物生長慢，組織培養體系較難建立。

本研究解決了外植體的表面消毒問題，建立了再分化器官葉狀體的無性繁殖系。在植物次生代謝工程中，利用快速增殖的分化器官培養物生產天然有效成分，具有較穩定的表達特征，例如以培養毛狀根生產中草藥有效成分的策略。因此本研究建立的葉狀體器官用于大規模培養生產石杉堿甲也可能表達較穩定，尤其該葉狀體增殖率高，或可成為次生代謝工程最好的體系之一。本研究將進一步篩選高產石杉堿甲的葉狀體培養系，為大規模蛇足石杉次生代謝工程生產石杉堿甲邁上更高臺階，具有重要的科學意義和應用價值。

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