千層塔中產石杉堿甲內生真菌的研究

董麗輝，范三微，凌慶枝*，錢海峰，魏兆軍

1浙江醫藥高等專科學校，寧波 315100;2 合肥工業大學生物與食品工程學院，合肥 230009

石杉堿甲(Huperzine A)分離自我國傳統中藥千層塔，其商品名為哈伯因，化學名為(5R，9R，11E)5-氨基-11-亞乙基-5，6，9，10-四氫-7-甲基-5，9-亞甲環芳辛并-2(1H)吡啶酮。藥理學研究表明石杉堿甲是一種高選擇性抑制乙酰膽堿酯酶(AChE)的藥物，能夠改善多種認知功能缺陷，治療重癥肌無力和早中期老性癡呆癥(Alzheimer's disease，簡稱AD)具有顯著療效。目前國際上已將石杉堿甲列為第二代乙酰膽堿酯酶抑制劑之一，1995 年石杉堿甲制劑在國內上市應用［1］。隨著老齡化社會的到來，對治療老年癡呆癥的藥物的需求量會越來越大，石杉堿甲僅依靠千層塔植物的提取遠不能滿足社會的需求，石杉堿甲來源問題已成為國內外研究的熱點。

內生菌是指那些在其生活史中的某一階段生活在植物組織內，對植物組織沒有引起明顯病害癥狀的菌。研究證實，生活在植物體的內生真菌與宿主植物具有相同的次生代謝產物的合成途徑，能產生與宿主相同或相似的，具有生理活性的代謝產物。自1993 年發現從短葉紅豆杉中分離出的內生真菌能夠合成抗癌成分紫杉醇以來［2］，人們希望通過尋找合適的內生真菌并使其發酵合成藥用成分，內生真菌有可能成為開發新型藥效活性物質的重要生物資源。前期的研究證實，千層塔植物中蘊含大量的內生真菌，這給篩選產石杉堿甲內生真菌提供了天然的資源。

本試驗從千層塔中分離到了不少有價值的內生真菌，在此基礎上對內生真菌的發酵產物進行乙酰膽堿酯酶抑制和清除DPPH·自由基能力的試驗，對內生真菌發酵提取物進行TLC 和HPLC 檢測，以便進一步篩選產石杉堿甲的菌株。

1 材料與方法

1.1 植物材料

供試材料千層塔Huperzia serrata (Thunb.)Trev.采自浙江杭州天目山脈。

1.2 儀器與試劑

TLC 板(GF254):煙臺江友硅膠開發有限公司;DIONEX-3000 高效液相色譜儀;電泳儀及電泳槽:美國Bio-Rad 公司;PCR 反應擴增儀:加拿大BBI 公司;3730 測序列分析儀:美國ABI 公司;多功能酶標儀:美國熱電公司。

乙酰膽堿酯酶(Acetylcholinesterase，AChE)、二苯代苦味酰基DPPH 標準品，均購自Sigma 石杉堿甲(Huperzine A，HupA)標品:中國食品藥品檢定研究院提供;色譜純甲醇:天津市四友精細化學品有限公司;引物ITS1(5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3')和ITS4(5'-TCC-TCCGCTTATTGATATGC-3'):由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。醋酸銨及其他試劑均為國產分析純或生物試劑。

1.3 方法

1.3.1 千層塔內生真菌的分離及發酵產物制備

選用新鮮藥用植物千層塔，洗凈后，流水沖洗4 h。在超凈工作臺上 按莖、葉、根分開。莖用0.1%升汞溶液消毒15 min。葉片和根在0.1%升汞溶液中浸泡10 min。取出材料，無菌水沖洗6 遍。在無菌條件下，將根莖葉分別切成0.5 cm 的長度接種于MS 培養基上。28 ℃培養40 d，將最后一次蕩洗的水涂布在平板上作對照。培養7 d 以后，對照板上并沒有菌生長，而千層塔的切口處有菌絲長出，用接種環將菌絲接種到新的PDA 培養基上，平板劃線分離，得到純的菌株。

采用馬鈴薯液體培養基培養內生真菌，28 ℃，120 rpm，培養10 d，收集菌絲，破碎細胞，用熱乙醇回流提取有效成分，濃縮提取液到1 mL。發酵液濃縮后用乙醇醇沉，除多糖，蛋白，濃縮到1 mL。保存于4 ℃冰箱備用。

1.3.2 內生真菌發酵產物AChE 抑制活性檢測

方法參照［3］的方法，在試管中加入內生真菌的菌絲或發酵液提物樣品20 μL、在15 μL 0.22 U/mL AChE、15 μL 15 mmol/L ATCI，加磷酸緩沖液50 μL，搖勻37 ℃恒溫30 min，加10 μL 4%十二烷基硫酸鈉，室溫下終止反應20 min，移入96 孔板上，加顯色劑125 μL 3 mmol/L，DTNB 顯色5 min，412 nm處酶標儀檢測，設為A樣品，每個樣品都設一個不加底物，反應條件和樣品一樣，測得值設為A本底，陰性對照用磷酸緩沖液代替樣品，反應條件與樣品一致，測定值設為A陰性，陽性對照不加底物，其它條件與陰性對照一致，測定值設為A陽性，以下列公式計算內生真菌對AChE 的抑制率(I):

1.3.3 內生真菌發酵提取物清除DPPH·自由基能力的測定［4］

取發酵液或菌絲體提取物樣品1 mL，加入2.4 mL 0.2 mmol/L DPPH 溶液，混勻，加水0.6 mL，室溫靜置暗反應30 min，測定517 nm 處的吸光度為A1。對照品用樣品溶劑替代，測得的吸光度為A2，未反應時DPPH 的值吸光度為A0。

1.3.4 TLC 檢測發酵產物

用2 cm×10 cm 的硅膠板，展開劑為:氯仿/丙酮/異丙醇(4∶6∶4)，顯色劑:0.3%高錳酸鉀溶液，用毛細管直接將0.4 μL 樣品和石杉堿甲標準品點在距薄層板一端約1 cm 處，點完干燥后將板置于展開液中，待展開到離板另一端約1 cm 處取出層析板，自然干燥。待溶劑基本揮發后，用噴霧器噴上顯色劑，吹干，記錄斑點，測Rf值。

1.3.5 HPLC 檢測發酵產物

采用DIONEX-3000 色譜系統，ODS-C18反相柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)，色譜條件為:流動相為甲醇:0.1 moL/L 醋酸銨(pH 6.0)(36∶64);流速1 mL/min，進樣量20 μL，柱溫25 ℃，檢測波長308 nm。稱取石杉堿甲標準品12.75 mg，于25 mL 的容量瓶中用流動相溶解置刻度。吸取石杉堿甲標準品溶液0.1、0.2、0.4、0.8、1.0 mL 置于10 mL 容量瓶中稀釋到刻度，樣品用流動相稀釋成5 mL 的溶液，膜過濾備用，根據石杉堿甲標準品色譜峰的保留時間對樣品定性，以峰面積與對應濃度繪標準曲線，并計算樣品中石杉堿甲的含量。

1.3.6 產石杉堿甲菌株的形態學鑒定

將內生真菌菌株接種于PDA 或查氏培養基上，對真菌菌落的形態特征進行觀察，將滅菌的濾紙于無菌水中濕潤，置于培養皿中，放上滅菌載玻片上，在載玻片上滴上一滴PDA 培養基，將真菌接種到培養基上，蓋上蓋玻片培養，培養后對菌株的菌絲、孢子囊等微觀形態進行觀察記錄。最后，比照《真菌鑒定手冊》［5］，鑒定所分離的內生真菌的種屬。

1.3.7 菌株的分子鑒定

將培養在PDA 上的內生真菌菌絲刮下，置于試管中，加500 μL CTAB 提取緩沖液，玻棒研磨，65 ℃保溫1 h，12000 rpm 離心10 min，取上清，飽和酚和氯仿異戊醇分別抽提后，用無水乙醇沉淀，12000 rpm 離心，倒出乙醇溶液，沉淀晾干后，溶于50 μL純水中備用。

PCR 擴增菌株ITS 區段:根據已知真菌的保守序列設計特異性引物ITS1(5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3')和ITS4(5'-TCC-TCCGCTTATTGATATGC-3')，以真菌基因組DNA 為模板，擴增菌株ITS區段。PCR 反應體系為:PCR 體系建立(25 μL):TempLate(基因組)1 μL，引物各(10 μmoL/L)0.5 μL，dNTP(各10 mmoL/L)0.5 μL，10 ×PCR Buffer 2.5 μL，Taq(5 U/μL)0.2 μL 加水至25 μL。反應條件:預變性94 ℃5 min;循環94 ℃30 s，55 ℃35 s，72 ℃1 min，35 個循環，延伸8 min。PCR 產物用1%凝膠電泳進行檢測，送交上海生工生物工程技術服務有限公司測序，序列提交到GenBank 核酸序列數據庫并得到登錄號。應用Blast 程序對所測得的內生真菌ITS 序列進行相似性比對。采用軟件ClustaLX 1.81 進行多序列的比較，比對結果采用DNAStar MegAlign 軟件進行系統進化樹的構建。

2 結果與分析

2.1 千層塔內生真菌的分離

從千層塔植物中分離到94 株內生真菌，對照培養基上并無菌生長，可以確定分離到的94 株為內生真菌，結果如表1 所示其中莖中所含內生真菌最多，為49 株，占總菌株數的52.12%;其次為葉片38株，占40.42%，根內最少，僅7 株，占7.44%。將內生真菌通過形態觀察分類可以將菌株歸到Penicillium、Cladosporium、Colletotrichum、Acremonium、Mortierella、Paraconiothyrium、Leptosphaeria、Shiraia、Arthrinium、Podospora 等12 個屬，其中Penicillium、Colletotrichum、Podospora 為優勢類群。

表1 千層塔不同組織中分離到的內生菌Table 1 Isolation of endophytic fungi from different parts of H.serrate

2.2 內生真菌發酵提取物抑制乙酰膽堿酯酶和清除DPPH·自由基能力檢測結果

將內生真菌發酵菌絲和發酵液提取物分別做抑制乙酰膽堿酯酶活性檢測和清除DPPH·自由基能力檢測，結果見表1。菌S29、S94、L44 這三株內生真菌有明顯活性。從表1 可見，菌絲體提取物對乙酰膽堿酯酶的抑制活性比發酵液提取物對乙酰膽堿酯酶的抑制活性高，而菌絲體提取物和發酵液提取物對DPPH 自由基的清除率比較接近。

表2 內生真菌發酵提取物對乙酰膽堿酯酶抑制率和DPPH·自由基清除率Table 2 DPPH· scavenging and AchE inhibitory activities of mycelium and fermentation broth of endophytic fungi

2.3 內生真菌發酵提取物TLC 檢測結果

將內生真菌的菌絲提取物和發酵液提取物和石杉堿甲標準品點樣層析，結果(圖1)顯示，S29 菌絲提取物中有石杉堿甲或其類似物，遷移率與石杉堿甲標準品接近，石杉堿甲和S29 菌絲提取物的遷移率分別為0.707、0.699，其他內生真菌發酵產物并未發現有遷移率與石杉堿甲標準品非常接近。

圖1 千層塔內生真菌S29(A)及石杉堿甲(B)的TLC 色譜圖Fig.1 TLC analysis results of HupA standard (A)and endophytic fungus S29 from H.serrate (B)

2.4 菌株S29 發酵提取物HPLC 測定結果

石杉堿甲標準品經過高效液相色譜檢測，不同濃度標準品都在保留時間5.97 min 有強的吸收峰(圖2A，C標準品=51 μg/mL，峰面積=27.152)不同濃度的標準品的峰面積與對應濃度繪制的標準曲線得回歸方程為:y=0.531x +0.2637，r2=0.9996，石杉堿甲在5.1～51 μg/mL 有良好的線性關系。菌株S29 的菌絲體提取物在保留時間5.940 min，有相似的吸收峰(圖2B，峰面積=6.168)并與其他雜質成良好的分離，S29 的發酵液體取物種并沒有類似的吸收峰，故推測S29 是產石杉堿甲的內生真菌，并且石杉堿甲在菌絲體中，應為胞內產物。根據標準曲線的回歸方程，計算出S29 樣品中石杉堿甲含量為11.12 μg/mL，共為5 mL，樣品中石杉堿甲量為55.60 μg，菌絲體的重量為1.098 g，故每克干菌體的石杉堿甲的含量50.64 μg。

圖2 石杉堿甲(A)及內生真菌S29 菌絲體(B)的HPLC 色譜圖Fig.2 HPLC chromatograms of HupA stardand (A)and strain S29 (B)

2.5 產石杉堿甲菌株S29 鑒定

產石杉堿甲菌株S29 接種于PDA 培養基中間28 ℃，培養6 d 菌落直徑為50 mm，培養到13～14 d可以鋪滿整個培養皿，菌落在生長4～6 d 顏色為黑色，略顯棕色，邊緣一圈為淡黃色，生長至整個平皿時邊緣為黑色，菌落中間為棕色，質地為絨狀，菌落中間有細小的顆粒狀，在PDA 培養基上反面為黑色，菌落邊緣一圈略先淡黃色，在查氏培養基上，培養4～5 d，菌落的直徑為45～50 mm，10 d 可以鋪滿整個平皿，在麥麩培養基上菌落易擴展，氣生菌絲較松散，橄欖綠色，無可溶性色素;在顯微鏡下觀察，菌絲有橫隔，顯微特征:玉米粉培養基上培養15 d，可見子囊果生長。菌絲發達，有隔，褐色，子囊果發育在菌絲層上，為球形無孔閉囊殼，單獨、表生，球形，直徑130～220 μm，無孔口;厚壁，棕褐色，子囊棍棒狀;子囊孢子深褐色，園形，厚壁，無芽孔(圖3)。

圖3 菌株S29 菌落及顯微特征Fig.3 Colony and microscopic characteristics of strain S29

2.6 菌株S29 的ITS 序列及發育分析

以ITS1 和ITS4 為引物，在菌株S29 基因組DNA 中擴增出一條516bp 的序列，在GenBank 登入獲得登入號(KC411775)。所得序列經BLAST 分析，結果表明該序列與1 株Podospora sp.XSD-39(序列EU273519.1)同源性達100%。在以DNAStar MegAlign 軟件構建的系統發育樹上，菌株S29 與Podospora sp.屬的進化距離也最近(圖4)。

圖4 菌株S29 基于ITS-rDNA 的系統發育和序列距離分析Fig.4 Phylogenetic and sequence distances analysis of strain S29 based on ITS-rDNA sequences

3 討論

本實驗從94 株內生真菌中篩選出3 株有顯著的抑制乙酰膽堿酯酶活性和清除DPPH·自由基能力的內生真菌。對內生真菌的發酵提取物進行TLC檢測發現，菌株S29 的遷移率與石杉堿甲標準品接近，對菌株的發酵提取物進行HPLC 檢測發現，菌株S29 菌絲體提取物保留時間與標準品非常相近，可以確定，菌株S29 的菌絲體中含有石杉堿甲，對菌株S29 進行經形態學和rDNA ITS 序列分析，判定此菌分類地位:子囊菌亞門(Mastigomycotina)核菌綱(Pyrenomycetes)球殼目(Sphaeriales)毛球殼科(Lasiosphaeriaceae)柄孢殼菌屬(Podospora)。Podospora sp.屬的植物分布非常廣泛，孫若瓊等［6］從12 株蛇足石杉中分離到一株可能產生石杉堿甲或其類似物的菌株190 號，對該菌株進行分子鑒定，該菌株為Podospora sp 屬，可見該屬的菌有產石杉堿甲的潛力。包麗霞等［7］從北細辛中分離到10 株菌，其中一株為Podospora sp.屬的菌株，該菌株具有抗腫瘤的活性。可見Podospora sp.屬真菌在植物中分布廣泛，它們的次級代謝產物非常豐富。

近年來國內外學者在千層塔內生真菌的分離到了產石杉堿甲的菌株數株，對其產量進行了測定。黎萬奎等［8］，從蛇足石杉中分離到的Acremonium sp.2F09P03B，產量為8.32 μg/mL，鞠鏨等［9］通過改進培養條件，從柳杉葉馬尾杉(Phlegmariurus crytomerianus)中分離出能產生石杉堿甲的內生真菌Blastomyces sp.HA15 和Botrytis sp.HA23，產石杉堿甲的產量為每克干菌絲20～30 μg。Zhu［10］等從蛇足石杉中分離到能產石杉堿甲的內生菌SLF14，其產量為每克干菌絲石杉堿甲含量為142.6 μg。現有的研究結果表明，從石杉科植物中也篩選出能產生石杉堿甲的內生真菌，這為石杉堿甲臨床應用提供了新的來源。本實驗篩選的菌株產石杉堿甲量還較低，難以產業化，因此對菌株進行改良，使石杉堿甲在宿主體內高效表達是未來研究的方向。

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