土人參提取液對D-半乳糖所致衰老小鼠的抗氧化作用研究

文全泰 ，潘廷啟，黃禮德，李蕓達，趙善民，何顯教，黃彥峰，晉 玲

1右江民族醫學院臨床學院;2 百色市人民醫院;3 右江民族醫學院 生理學教研室，百色 533000

土人參［Talinum paniculatum (Jacq.)Gaertn.］為馬齒莧科土人參類植物，別名為櫨蘭、假人參等。有補中益氣，養陰潤肺，消腫止痛，主治脾虛、食少乏力、泄瀉、脫肛、肺癆咳血、潮熱、盜汗，產后乳汁不足等癥［1］，研究表明土人參含有的成分為齊墩果酸、蔗糖等［2］，而其中多糖具有免疫調節、抗腫瘤、降糖、保肝、抗感染、抗消化道潰瘍、抗衰老、降血脂、抗凝血等作用［3］。也有研究表明土人參含環烯醚萜，有類似地黃養陰、生津、益精填髓的作用，同時含三萜皂苷，亦有類似人參大補元氣，補脾益氣、生津、安神、增強免疫機能之功效。此外尚含香豆素類、揮發油等［4］。目前國內外關于土人參抗氧化的研究僅有張健，劉關艷通過測定土人參葉和根中的抗氧化物質的含量和抗氧化酶的活性，得出土人參中SOD活性較高，總抗氧化能力較強［5］，但其未對動物進行任何實驗研究，因此在動物方面的研究尚存欠缺，為此本次實驗以不同濃度的土人參提取液對D-半乳糖所致衰老小鼠心、肝組織中SOD 和MDA 含量以及血清中GSH-PX 活性的影響來研究其抗氧化能力，這樣即進一步探討土人參的抗氧化作用，也為土人參的臨床藥物應用提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

昆明種3 月齡清潔級小白鼠50 只，雌雄各半，體重35～45 g，由廣西右江民族醫學院動物實驗中心提供(許可證號:SYXK 桂2011-0010)。土人參采摘于廣西天等縣高州山，由右江民族醫學院民族醫學教研室覃道光副教授鑒定為馬齒莧科土人參類植物;D-半乳糖(批號20120718)，購自美國Amresco公司，用生理鹽水配成1.25%的濃度。超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒(批號20121120)、丙二醛(MDA)試劑盒(批號20121118)、考馬斯亮蘭試劑盒(批號20121120)和谷胱甘肽過氧化物酶(GSHPX)試劑盒(批號20121122)均購自南京建成生物工程研究所。

電熱恒溫水浴鍋(江蘇金壇宏凱儀器廠);TDZ4A-WS 低速臺式離心機(長沙湘儀離心機儀器有限公司);FSH-2A 可調高速電動勻漿機(金壇市金南儀器廠);電熱煮沸消毒器(100 度恒溫水浴鍋)(上海市化工進出口有限公司);722 型分光光度計(上海精密科學儀器有限公司);SW-80A 型旋渦混合器(上海醫大儀器廠);ARll40/C 電子天平［奧豪斯(上海)公司生產］。

1.2 實驗方法

1.2.1 土人參提取液制備

稱取500 g 土人參干品，先用適量蒸餾水浸泡1 h，再加入部分蒸餾水，兩次共為干品10 倍，煮沸30 min，自然冷卻至室溫后過濾，保存為濾液1;同法再加入8 倍的蒸餾水，煮沸30 min 后過濾，保存為濾液2。將1、2 液混合，減壓濃縮至100%(1 mL 含生藥1 g)，作為原藥液，置于5 ℃冰箱保存備用，臨用前按比例配制成高劑量為15 g/kg，中劑量10 g/kg，低劑量為5 g/kg。

1.2.2 動物的分組及造模

取體重35～45 g 的昆明種小白鼠50 只，適應性飼養7 d 后，將小鼠隨機分為5 組，每組10 只，即為正常對照組、衰老模型組、土人參提取液高、中、低劑量組。D-半乳糖衰老小鼠模型的建立及給藥方法參照文獻［6］方法制備亞急性衰老小鼠模型。即土人參提取液低、中、高劑量組及衰老模型組每日定時頸背部皮下注射(125 mg/kg［7］體重)的D-半乳糖滅菌生理鹽水溶液(新鮮配制，其濃度為1.25%)，正常對照組頸背部皮下注射等量的生理鹽水，連續42 d。同時，將土人參提取液分別配成劑量為15、10、5 g/kg 依次給高劑量組、中劑量組、低劑量組灌胃，正常對照組和衰老模型組給予等量的生理鹽水灌胃，每天灌胃1 次，連續給藥42 d，并于每周稱量體重后，根據體重準確調整給藥量及D-半乳糖注射量，并保持給藥的連續性和準確性。

1.2.3 血清及組織勻漿液的制備

于42 d 后對各小組小鼠采用摘除眼球法，取血0.5～1.0 mL 放入容積為1 mL 的三角試管中，以3500 rpm，離心10 min，取上清液備用。隨即采用頸椎脫臼法處死小鼠，迅速取出其心、肝組織，用冰凍生理鹽水洗凈，濾紙吸干稱重，用勻漿機勻漿(15000 rpm，連續3～5 次)制備成10%的組織勻漿液，備用。并根據試驗要求取部分10%的組織勻漿液用生理鹽水按1∶9 稀釋成1%的組織勻漿液，加藥并離心(3000 rpm，10 min)，制備成1%的組織勻漿液，備用。

1.2.4 生化指標檢測

小鼠血清中的GSH-PX 和心、肝組織中的蛋白量、SOD、MDA 含量的測定均按南京建成生物工程研究所提供的試劑盒說明書方法進行操作。

1.2.5 統計學分析

所有數據均用SPSS 17.0 統計軟件包進行處理，計量資料數據以均數±標準差(x ±S)表示，資料進行正態性檢驗;多組計量資料采用one-way ANOVA，方差齊時采用LSD，方差不齊時采用Dunnett's C 法。P ＜0.05 有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 土人參提取液對D-半乳糖所致衰老小鼠血清GSH-PX 和心、肝組織SOD 含量的影響

與正常對照組相比，衰老模型組小鼠血清中GSH-PX 和心、肝組織中的SOD 含量明顯降低，具有顯著差異(P ＜0.01);與衰老模型組相比，土人參提取液低、中、高劑量組小鼠血清中的GSH-PX 和心臟、肝臟中的SOD 含量均明顯升高，具有顯著差異(P ＜0.01)，結果見表1、2。

表1 土人參提取液對D-半乳糖所致衰老小鼠心、肝組織SOD 含量的影響(x ±S，n=10)Table 1 Effects of T.crassifolium extract on SOD in heart and liver tissue of aged mice induced by D-galactose (x ±S，n=10)

表2 土人參提取液對D-半乳糖所致衰老小鼠血清中GSHPX 含量的影響(x ±S，n=10)Table 2 Effects of T.crassifolium extract on GSH-PX in serum of aged mice induced by D-galactose (x ±S，n=10)

注:與正常對照組比較，1)P ＜0.05，2)P ＜0.01;與模型組比較，3)P＜0.05，4)P ＜0.01。Note:Compared with normal control group，1)P ＜0.05，2)P ＜0.01;Compared with model group，3)P ＜0.05，4)P ＜0.01.

2.2 土人參提取液對D-半乳糖所致衰老小鼠心、肝組織MDA 含量的影響

與正常對照組相比，衰老模型組小鼠心臟、肝臟的MDA 含量明顯升高，具有顯著差異(P ＜0.01);與衰老模型組相比，土人參提取液中、高劑量組小鼠心臟、肝臟中的MDA 含量明顯降低，具有顯著差異(P ＜0.01)，但是土人參提取液的低劑量組中的心臟的MDA 降低不明顯(P ＞0.05)，而土人參提取液低劑量組小鼠肝臟MDA 含量明顯降低，具有顯著差異(P ＜0.01)，結果見表3。

表3 土人參提取液對D-半乳糖所致衰老小鼠心、肝組織MDA 含量的影響(x ±S，n=10)Table 3 Effects of T.crassifolium extract on MDA in heart and liver tissues of aged mice induced by D-galactose (x±S，n=10)

3 討論

自上世紀二十年代自由基學說創立以來，對于自由基損傷的研究就不斷深入。許多研究證實，體內自由基含量是隨著年齡增長而積累的，但體內產生抗氧化劑和氧化酶能力卻隨年齡增加而逐漸下降。自由基的氧化可出現肌膚衰老，色斑，松弛，免疫系統衰退及全身性老化等一系列現象，因此，減少自由基的產生及尋找有效的抗氧化性藥物，對人類的生命與健康有著重要意義。本實驗通過與D-半乳糖所致衰老模型相對比，來研究土人參提取液的抗氧化作用。

研究表明大劑量D-半乳糖可引起多組織基因表達與調控異常、細胞增殖分化能力下降及細胞退行性改變等表現，其機制可能是D-半乳糖誘導活性氧增多，脂質過氧化亢進，產生超氧陰離子自由基［8］。同時脂質過氧化分解產物MDA 能使DNA、蛋白質發生交聯，影響細胞的分裂，破壞蛋白和酶的結構和功能［9］，因此，測試MDA 的量常可反映機體脂質過氧化的程度，同時也可間接地反映出細胞損傷程度。從實驗結果可知，與正常對照組小鼠相比，衰老模型組小鼠中的心、肝臟組織中MDA 的含量明顯的升高，說明由D-半乳糖所致衰老模型組小鼠已經出現細胞損傷，并達到一定程度，同時也表明衰老模型是制備成功的。而土人參提取液中、高劑量組小鼠心臟、肝臟中的MDA 含量與衰老模型組相比也明顯降低，土人參提取液低劑量組小鼠肝臟MDA 含量同樣明顯降低。說明土人參提取液具有抑制MDA 生成，減少細胞損傷的作用。

谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)是機體內廣泛存在的一種重要的催化過氧化氫分解的酶。它特異的催化還原型谷胱甘肽對過氧化氫的還原反應，可以起到保護細胞膜結構和功能完整的作用。超氧化物歧化酶(SOD)對機體的氧化與抗氧化平衡起著至關重要的作用，此酶能清除超氧陰離子自由基保護細胞免受損傷。從實驗結果可知:土人參提取液三個劑量組小鼠血清中的GSH-PX 和心臟、肝臟中的SOD 活性與衰老模型組相比均有明顯升高，說明土人參提取液可以通過提高SOD 和GSH-PX 的活性，從而達到抗自由基氧化及保護細胞膜結構的作用。土人參對抗衰老與提高免疫力、抗疲勞有緊密聯系，對中樞神經系統的調節，控制內分泌，延緩細胞衰老進程，全面提高人體免疫等起明顯的作用，是一種難得的滋補強壯劑，有促進人的食欲、睡眠、疲乏等癥狀的改善，這種功效可能是土人參中的環烯醚萜、三萜皂苷及糖類等成分起作用。因此綜合以上分析證明土人參提取液具有抗氧化，延緩衰老的作用。

研究表明土人參是比較安全且無毒性的植物［10］，同時在價格上相對便宜，并且野外生長資源豐富，因此可以根據土人參的抗氧作用，將其由原來的野生植物變成預防衰老的保健產品，這樣不僅可以充分發揮土人參的藥用功效，而且也為人類的健康做出貢獻，同時也展示出我國中草藥的獨特魅力。

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