廣州蛇根草化學成分及其抗菌活性的研究

李維峰，宋啟示，項 偉，王婭玲

1云南熱帶作物職業(yè)學院，普洱 665000;2 中國科學院西雙版納熱帶植物園，昆明 650223

廣州蛇根草為茜草科Rubiaceae 蛇根草屬植物Ophiorrhiza cantoniensis Hance 的全草，主要分布于云南、廣州、海南、廣西、貴州等地。《中藥大辭典》記載:蛇根草(日本蛇根草)具有“活血化淤。治療治咳嗽、勞傷吐血，跌打，月經(jīng)不調(diào)”的功效。目前對于蛇根草屬植物化學成分的研究比較少，國內(nèi)僅見有對蛇根草、日本蛇根草等化學成分研究的報道［1-4］，研究發(fā)現(xiàn)該屬植物含有主要藥用成分為喜樹堿、10-甲氧基喜樹堿、谷甾醇和麥角甾醇等化合物［5］。

為了探明廣州蛇根草有效成分及其抗菌活性，筆者對其全草進行了化學成分研究，從中分離到了3 個化合物，分別鑒定為:β-谷甾醇(1)、β-胡蘿卜苷(2)、喜果苷(3)。其中化合物1、2、3 均為首次從該植物中得到;并且采用濾紙片法對廣州蛇根草乙醇提取物的不同極性萃取部分和上述三種化合物進行了抗菌試驗，發(fā)現(xiàn)其乙醇提取物的石油醚萃取部分和氯仿萃取部分具有較強的抗菌活性。

1 材料與方法

1.1 材料

廣州蛇根草樣品采集于云南省勐臘縣勐侖鎮(zhèn)，經(jīng)中國科學院西雙版納熱帶植物園植物標本室鑒定為茜草科植物廣州蛇根草(Ophiorrhiza cantoniensis Hance)帶花全草。樣品標本保存于中國科學院西雙版納熱帶植物園民族藥與功能食品組。

1.2 儀器

熔點在SGW X-4 顯微熔點儀上測定(溫度計未校正);核磁共振譜用Bruker AM-400、DRX-500 測定，TMS 為內(nèi)標;質(zhì)譜用英國VG 公司VG-AutoSpec-3000 型測定;柱層析硅膠(200～300 目)、薄層硅膠板(50 mm×100 mm)均為青島海洋化工廠生產(chǎn);大孔樹脂DM-130 由山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司生產(chǎn);反向材料使用MCI。無菌操作臺(上海凌初環(huán)保儀器有限公司公司)，智能光照培養(yǎng)箱(寧波東南儀器有限公司)，壓力蒸汽滅菌器(上海醫(yī)用核子儀器廠)，純水機(北京普析)。

1.3 菌種與培養(yǎng)基

供試菌株包括真菌和細菌兩大類，其中細菌有枯草芽孢桿菌(Bacillus subtlis)、藤黃微球菌(Micrococcus luteus)、大腸桿菌(Escherichia coli)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、藤黃八疊球菌(Sarcina ureae);真菌有白色念珠菌(Candida albicans)、黑曲霉(Aspergillus niger)、清酒酵母菌(Saccharomyces sake)(購自中國藥品生物制品檢定所)。

真菌用馬鈴薯培養(yǎng)基(PDA 培養(yǎng)基)培養(yǎng)，細菌用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基培養(yǎng)。

PDA 培養(yǎng)基:用去皮馬鈴薯200 g 切成薄片煮沸30 min，然后用紗布過濾，再加葡萄糖20 g 及瓊脂15 g，補水至1000 mL。

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基:牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，水1000 mL，瓊脂15 g，混合后調(diào)PH 值至7.0～7.2。

1.4 蛇根草化學成分的提取與分離

廣州蛇根草全草2.85 kg，粉碎后采用浸漬法用95%乙醇于室溫下提取3 次，每次浸泡24 h。合并提取液，過濾，減壓濃縮、蒸干得到乙醇浸膏285.5 g，浸膏用5 倍量的水分散均勻后依次用石油醚、氯仿、正丁醇萃取，每種溶劑各萃取4 次，得到石油醚萃取物42 g，氯仿萃取物27.9 g，正丁醇萃取物140 g，此外還有剩余的水溶部分。石油醚部分以三倍量硅膠(100 目)拌樣后以1.2 kg(200～300)目硅膠柱層析，石油醚-丙酮混合溶劑梯度洗脫(1∶0，9∶1，8∶2，7∶3，5∶5，3∶7，0∶1)，從而得到化合物1(3.2 g)。

氯仿萃取物以三倍量硅膠(100 目)拌樣以后以900 g 硅膠(200～300 目)柱層析，石油醚-丙酮混合溶劑梯度洗脫(1∶0，9∶1，8∶2，7∶3，5∶5，3∶7，0∶1)，從而得到化合物2(0.15 g)。

正丁醇萃取物用水溶解之后上大孔樹脂柱分段，水-甲醇混合溶劑梯度洗脫(8∶2，7∶3，0∶1);其中水:甲醇=7:3 洗脫劑沖下部分上反向MCI 進行柱層析。從而得到化合物3(0.35 g)。

2 結果與分析

2.1 化學成分鑒定

化合物1 C29H50O，M414，無色片狀結晶(丙酮)，mp.137～139 ℃，Lieberman-Buchard 反應(醋酐-濃硫酸反應)顯紫紅色后迅速變?yōu)榫G色，Salkowski 反應(濃硫酸-氯仿反應)呈陽性;1H NMR(500 MHz，CDCl3)譜顯示有δ5.28(1H，d，J=5.1 Hz，6-H)烯氫信號和δ3.45(1H，m，3-αH)連氧碳上的氫信號，δ0.94(3H，s，19CH3)和δ0.61(3H，s，18CH3)為角甲基上的氫信號，δ0.85(3H，d，J=6.3 Hz)，δ0.78(3H，t，J=6.8 Hz)，δ0.77(3H，d，J=6.6 Hz)為甲基上的信號;該化合物與β-谷甾醇對照品共進行薄層層析，石油醚:乙酸乙酯(4∶1)和石油醚:乙醚(2∶1)展開，Rf值一致，以上信息及數(shù)據(jù)與參考文獻報導一致［6，7］，確定該化合物為β-谷甾醇(β-sitosterol)。

化合物2 C35H60O6，M576，白色無定形粉末(MeOH)，mp.281～282 ℃，Lieberman-Buchard 反應(醋酐-濃硫酸反應)陽性，Molish 反應陽性，1H NMR(500 MHz，DMSO)譜有δ5.29(1H，brs，6-H)烯氫信號，δ4.18(1H，d，J=7.2 Hz)糖基端上氫信號，呈β構型，δ:2.84～δ4.20 范圍內(nèi)存在糖基上的多個質(zhì)子。δ:0.99 (3H，s，19CH3)和δ:0.63 (3H，s，18CH3)為角甲基上的氫信號，δ:0.88(3H，d，J=6.3 Hz)，δ:0.86 (3H，t，J=6.0 Hz)，δ:0.81(3H，d，J=5.4 Hz)和δ:0.79 (3H，d，J=6.0 Hz)為甲基上的氫信號;13C NMR(500 MHz，DMSO)δ:27.94(t，C-2)，73.46(d，C-3)，42.3(t，C-4)，140.46(s，C-5)，121.16(d，C-6)，31.42(t，C-7)，31.42(d，C-8)，49.62(d，C-9)，36.51(s，C-10)，20.59(t，C-11)，39.85(t，C-12)，41.85(s，C-13)，56.18(d，C-14)，24.33(t，C-15)，29.26(t，C-16)，55.45(d，C-17)，11.65(q，C-18)，19.07(q，C-19)，36.15(d，C-20)，18.61(q，C-21)，33.94(t，C-22)，25.42(t，C-23)，45.85(d，C-24)，29.16(d，C-25)，18.93(q，C-26)，19.68(q，C-27)，22.51(t，C-28)，11.77(q，C-29)，100.82(d，C-1')，76.98(d，C-2')，76.77(d，C-3')，76.71(d，C-4')，73.46(d，C-5')，61.10(t，C-6')。以上光譜數(shù)據(jù)與文獻［8］報道對照，確定該化合物為β-胡蘿卜苷(daucosterol)。

化合物3 C26H30N2O8，M498，無色針狀結晶(MeOH)，mp.201～202 ℃，1H NMR(C5D5N，400 MHz)δ:7.55(1H，d，J=7.9 Hz，H-9)，7.28(1H，m，H-17)，7.24(1H，d，J=7.9 Hz，H-12)，4.71(1H，d，J=7.9 Hz，H-1')，2.71(2H，m，H-20)，2.33(1H，dt，J=13.2，3.8 Hz，H-14b)，2.86(2H，m，H-6a，b)，13C NMR(C5D5N，400 MHz)δ:170.34(s，C-22)，150.68(d，C-17)，135.55(s，C-2)，133.78(d，C-19)，133.54(s，C-13)，125.98(s，C-8)，122.00(d，C-11)，119.96(d，C-10)，117.61(d，C-9)，116.21(t，C-18)，111.33(s，C-7)，110.09(d，C-12)，105.74(s，C-16)，98.92(d，C-1')，94.58(d，C-21)，77.18(d，C-3')，76.58(d，C-5')，72.95(d，C-2')，69.69(d，C-4')，60.91(t，C-6')，48.96(d，C-3)，43.34(d，C-20)，40.05(t，C-5)，34.72(t，C-14)，31.10(d，C-15)，19.36(t，C-6)。以上光譜數(shù)據(jù)與文獻［9-11］報道對照，確定該化合物為喜果苷(長春苷內(nèi)酰胺，vincoside-lactam，VCS-LT)。

2.2 抗菌活性測定

抗菌試驗采用濾紙片法。預先把各種供試菌用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、PDA 斜面培養(yǎng)基分別對細菌和真菌進行菌種活化，培養(yǎng)2～3 d 后各加入3 mL無菌水制成菌懸液備用。

將三張定性濾紙疊放，用打孔器打成若干直徑約為5.5 mm 的圓形濾紙片，滅菌后備用。

配制固體培養(yǎng)基，滅菌，待其溫度降至約50 ℃時，加入菌懸液，搖勻，倒平板，待平板凝固后用滅菌鑷子夾取濾紙片浸取待試樣品的二甲亞砜溶液貼在上述各種含菌培養(yǎng)基上，濾紙片在每個平板內(nèi)間隔一定距離，每個平板內(nèi)設浸有二甲基亞砜的濾紙片一枚作空白對照，用浸有1 U/mL(1U 單位，0.6 μg為1U 單位)、100 U/mL 兩種濃度的青霉素鈉溶液的濾紙片作陽性對照，然后將各平板放入適宜的溫度培養(yǎng)(細菌于37 ℃，真菌于28 ℃)，24 h 后取出，用十字交叉法測量抑菌圈直徑，取其平均值作為試驗結果。

廣州蛇根草樣品乙醇提取物的氯仿萃取部分對大腸桿菌和枯草芽孢桿菌具有較弱的抑菌活性，石油醚萃取部分對金黃色葡萄球菌具有較弱的抑菌活性，水提物則無明顯抑菌活性，說明其不含抑菌活性成分。化合物1(β-谷甾醇)對大腸桿菌和枯草芽孢桿菌具有中等抑制活性，但化合物2(β-胡蘿卜苷)、3(vincoside-lactam)則無明顯抑菌活性(表1)。供試樣品及對照試劑對真菌類供試菌均未顯示出抗菌活性。

表1 廣州蛇根草各萃取物及單體化合物對細菌抑制試驗結果(n=3)Table 1 Inhibition of substances of Ophiorrhiza cantoniensis to bacteria

3 討論

從廣州蛇根草中得到的三種化合物，并在初提物中分離到大量的無機鹽。其中化合物3 為喜果苷(長春苷內(nèi)酰胺，vincoside-lactam，VCS-LT)，且得到的量較大(0.35 g)，研究表明喜樹堿類化合物和喜果苷均具有顯著抗白血病和抑制腫瘤活性［1］;前人報道中均為從喜樹的果實等部位提取喜果苷，筆者首次從廣州蛇根草中分離得到喜果苷，發(fā)現(xiàn)了新的喜果苷來源，對于開拓新的抗癌藥物資源具有重要意義。

另外試驗中還得到了大量的β-谷甾醇(3.2 g)和胡蘿卜苷(0.15 g)，說明該種植物的主要藥效成分可能為喜果苷和β-谷甾醇等化合物［5］。

本試驗從抑菌方面證實，廣州蛇根草氯仿部分和石油醚部分均含有抑菌活性物質(zhì)，而β-谷甾醇由石油醚萃取物中得到且量很大(3.2 g)，β-谷甾醇具有較強的抗菌活性［12］，則說明該甾醇化合物可能為廣州蛇根草中主要的抑菌活性物質(zhì)，此化合物為脂溶性化合物，在水溶部分中含量極微或者不含該化合物，所以水溶部分顯示無抗菌活性。

1 Wall ME，Wani MC，Cook CE，et al.Antihumor agent I.The isolation and structure of Campto-thecin，a novel alkaloidal leukemia and tumor inhibitor form Camptotheca acuminate.Amer Chem Soc，1966，88:3888.

2 Kitajima M，Nakamura M，Takayama H，et al.Constituents of regenerated plants of Ophiorrhiza pumila;formation of a new glycocamptothecin and predominant formation of(3R)-deoxypumiloside over(3S)-congener.Tetrahedron Letters，1997，38:8997.

3 Hsiang YH，Hertzberg R，Hecht S et al.Camptothecin induces protein-linked DNA breaks via manmalian DNA topoisomerase I.Bio Chem，1985，260:14873.

4 Rowe PM.Camptothecin:new enthusiasm for an old drug.Lancet，1995，3:892.

5 Luo XR(羅獻瑞).Taxonomic revision of the chinese species of ophiorrhiza(rubiaceae).Bulletin of botanical research(植物研究)，1990，10(2):1.

6 Tian J(田軍)，Wu FE(吳鳳鍔)，Qiu MH(丘明華).Chemical constituents of Pterocephalus Hook-eri.Nat Prod Res Dev(天然產(chǎn)物研究與開發(fā))，2000，12(1):35.

7 He MF(何明芳)，Meng ZM(孟正木)，Wo LQ(沃聯(lián)群).Study on constituents of Centella asiatica(L.)Urb .J China Pharm Univ(中國藥科大學學報)，2000，31:91.

8 Kojima H，Sato N，Hatano A，et al.Steroid glucosides from Prunella vulgaris.Phytochemistry，1990，29:2351.

9 Aimi N，Shito T，F(xiàn)ukushima K，et al.Studies on plant containing indole alkaloids.Ⅷindole alkaloid glycosides and other constituents of the leaves of Uncaria rhynchophylla Mio.Chem Pharm Bull，1982，30:4046.

10 Takayama H，Ohmori O，Subhadhirasakul S，et al.Deeper insights into the stereostructure of strictosamide tetraacetate and methylisoalangiside tetraacetate，the key reference molecules in monoterpenoid indole and isoquinoline glucoalkaloids.Chem Pharm Bull，1997，45:1231.

11 Erdelmeier CA，Wright A D，Orjala J，et al.New indole alkaloid glycosides from Nauclea orientalis.Planta Medica，1991，57:149.

12 Wuhanqimuge(烏漢其木格).Studies on Extraction and Characteristic Analysis of β-sitosterol in Bare Oat Bran.Huhehaote:Inner Mongolia Agricultural University(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學)，PhD.2007.