中壓液相色譜法快速制備木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷單體及鑒別

陳家驕 ，王鳳玉，田旭輝，鄧昌瑞，黃小萍，王 東，劉東春*

1沈陽藥科大學中藥學院;2 沈陽藥科大學中韓分子生藥學研究室，沈陽 110016

苦碟子注射液是由抱莖苦荬菜(苦碟子)Ixeris sonchifolia (Bge)Hance 為原料經過現代工藝科學精制而成的靜脈注射劑，在冠心病、心絞痛及腦梗塞方面的臨床療效顯著［1，2］。黃酮苷類成分是苦碟子注射液中的主要有效成分之一，其中以木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷(L7GU，圖1)在制劑中含量最高，適合用于注射劑的質量控制［3-5］。但是大規模制備高純度的L7GU 對照品比較困難，目前尚未有L7GU 的國家標準對照物可用于注射劑的質量控制。本研究旨在建立一種快速制備高純度L7GU 對照品的方法，可滿足苦碟子注射劑等相關制劑的質量控制需求及其藥用活性的深入研究。

圖1 木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷的結構式Fig.1 Chemical structure of luteolin-7-O-β-D-glucuronide

1 材料與儀器

苦碟子藥材采于遼寧省沈陽地區，經沈陽藥科大學生藥學教研室劉東春副教授鑒定為菊科植物抱莖苦荬菜Ixeris sonichifolia (Bge.)Hance 的干燥全草;D101 大孔樹脂(滄州寶恩化工有限公司);Chromatorex C18制備色譜填料(C18MB 100-40/75，日本Fuji Sylysia Chemical Ltd.);高效硅膠薄層板(HPTLC GF254，德國Merck 公司)。

顯色劑:2%(W/V)的三氯化鋁乙醇溶液;TLC展開劑:(1)三氯甲烷/甲醇/冰醋酸/水80∶30∶25∶7.5，(2)正丁醇/冰醋酸/水4∶1∶5 上層;色譜甲醇、色譜乙腈、色譜甲酸(美國fisher);其他試劑均為分析純。

高效液相色譜儀(具自動進樣器，UV 檢測器，LC-2010A，日本島津公司)，色譜工作站軟件Class-VP Ver.6;中高壓液相色譜制備系統(MPLC-20，蘇州匯通色譜分離純化有限公司);中高壓制備色譜塔(φ49 mm×H310 mm，蘇州匯通色譜分離純化有限公司);冷凍干燥機(LGS-18，北京松源華興科技發展有限公司);旋轉蒸發儀(N-1100，東京理化器械株式會社);紫外分光光度儀(UV-1700，日本島津制作所);傅立葉變換紅外光譜儀(IFS55，德國Bruker 公司);飛行時間質譜儀(micrOTOF-Q，德國Bruker 公司);超導核磁共振儀(Bruker Avance 600，TMS 內標，瑞士布魯克公司)。

2 方法與結果

2.1 苦碟子總黃酮的制備

2.1.1 苦碟子濃縮液的制備

將苦碟子藥材50 kg，加水煎煮兩次，第一次1 h，第二次0.5 h，合并煎煮液，濃縮至每1 mL 相當于原生藥0.5 g，放冷至40 ℃以下，在攪拌下加10%氫氧化鈣乳調節pH 值至10，放置12 h，離心，離心沉淀物稱重，混懸于5.3 倍量95%乙醇中，使含醇量達80%，加50%硫酸溶液調節pH 值至3～4，充分攪拌使反應完全，離心，轉移上清液并加40%氫氧化鈉溶液中和pH 值至7.0，濾過，濾液回收乙醇，并揮盡乙醇，得到苦碟子濃縮液(約相當于原生藥5～6 g/mL)備用［6］。

2.1.2 大孔樹脂富集純化黃酮類化合物

D101 大孔樹脂裝入洗脫柱(φ10 ×150 cm)，去離子水洗脫至流出液澄清，用95%乙醇浸泡過夜后洗脫，至流出液不渾濁，用去離子水洗至無醇味待用。取苦碟子濃縮液，加水稀釋。(約相當于原生藥2.0 g/mL)，用硫酸(50%，v/v)調pH 值4～4.5。以100 mL/min(約0.5 BVe/h)的流速緩慢將上樣吸附液加至樹脂柱的上端，同時打開樹脂柱出口閥門，使流出速度與流入速度相等。吸附完成后，依次用去離子水，10%、50%、95%的乙醇進行梯度洗脫。以3 BVe/h 流速進行洗脫，每一梯度的洗脫液顏色明顯變淡(約8 BVe/梯度)后即更換到下一梯度繼續洗脫，收集50%乙醇洗脫部分，減壓回收至干，得到黃酮粗提取物。

2.2 MPLC 法分離提純L7GU 單體

稱取上述黃酮粗提物2 g，加入200 mL 超純水，超聲使溶解完全，必要時過濾待用;將此粗黃酮溶液注入色譜塔，以流動相(A:甲醇，B:0.05%冰醋酸水溶液)進行梯度洗脫，梯度洗脫程序:0～20 min，10%(A);20～230 min，30%(A);230～270 min，60%(A);270～300 min，100%(A)，流速:50 mL/min，檢測波長254 nm，收集100～180 min 流份，減壓蒸餾除去甲醇后，冷凍干燥得到黃色無定型粉末1.36 g。制備色譜圖見圖2。

圖2 中壓液相色譜系統制備L7GU 圖譜Fig.2 MPLC chromatogram of total flavonoid of I.sonchifolia for the isolation of L7GU

2.3 L7GU 結構確證

產品為黃色無定型粉末，可溶于甲醇、乙醇、乙腈、水，易溶于四氫呋喃、吡啶。鹽酸-鎂粉反應和Molish 反應均呈陽性，提示為黃酮苷類化合物。UV(MeOH)λmax(log ε)348 (2.85)，257 (2.85)，209(3.04)nm，λmin(log ε)295 (2.44)，236 (2.67)nm，與文獻報導木犀草素的UV 光譜基本一致［7，8］;ESI-MS:m/z 463.0896 ［M +H］+(calcd.for C21H18O12，463.0896);IR (KBr)νmax3425，2923，2853，1734，1658，1601，1499，1446，1383，1335，1304，1258，1171，1092，1033，839，684，622;1H NMR (DMSO-d6，600 MHz):δH13.00 (1H，s，H-5)，7.43 (1H，s，H-2')，6.93 (1H，d，J=8.4 Hz，H-5')，7.45(1H，dd，J=8.4 Hz，H-6')，6.47 (1H，d，J=1.8Hz，H-6)，6.83(1H，d，J=2.4 Hz，H-8)，6.77(1H，s，H-3)，5.30 (1H，d，J=7.2 Hz，H-1a)，根據偶合常數確定葡萄糖構型為β 構型;13C NMR (DMSO-d6，150 MHz)，δ:164.6 (C-2)，103.3(C-3)，182.0 (C-4)，161.3 (C-5)，99.3 (C-6)，162.6 (C-7)，94.7 (C-8)，157.1 (C-9)，105.6 (C-10)，121.5(C-1')，113.7 (C-2')，145.9 (C-3')，150.0 (C-4')，116.1 (C-5')，119.3 (C-6')，99.5 (Glc-1)，72.9 (Glc-2)，75.5 (Glc-3)，71.4 (Glc-4)，75.7(Glc-5)，170.3 (Glc-6)。測得的氫譜和碳譜數據與文獻［8-10］報道的木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷的數據基本一致，確定為木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷。

2.4 L7GU 的純度檢查

2.4.1 薄層色譜純度檢查

取上述成品適量，加甲醇制成每1 mL 含0.5 mg 的溶液。作為供試品溶液。參照藥典薄層色譜法試驗(中國藥典2010 年版一部，附錄VI B)，吸取上述供試品溶液0.2 μL，分別點樣于高效硅膠薄層板GF254和聚酰胺薄層層析板，以正丁醇/冰醋酸/水4∶1∶5、三氯甲烷/甲醇/冰醋酸/水80∶30∶25∶7.5 為展開劑，分別各自展開，展開完畢后，揮干展開劑，噴以2%三氯化鋁乙醇溶液，105 ℃加熱數分鐘，置紫外光燈(365 nm)下檢視，兩種不同的展開體系下的供試品色譜中，均呈單一的黃綠色熒光斑點，且原點無色斑殘留，表明本品為單一化合物。薄層色譜圖見圖3。

2.4.2 HPLC-UV 法純度標定

圖3 L7GU 樣品的薄層層析檢查Fig.3 TLC analyses of L7GU

L7GU 樣品干燥參照中國藥典2010 年版一部附錄IX H 水分測定法第三法，采用五氧化二磷為干燥劑，室溫減壓干燥24 h 后迅速精密稱取干燥樣品適量，配制成約50 μg/mL 樣品甲醇溶液;

分析色譜條件:液相色譜儀:SHIMADZU LC-2010A，紫外-可見檢測器;色譜柱Utimate AQ C-18(4.6 ×150 mm，5 μm，Welch Materrials Inc.)柱;保護柱C18(4 ×3.0 mm，Phenomenex);流動相:甲醇/水(水相中含0.5%甲酸)38∶62;流速:1 mL/min;進樣量10 μL;柱溫40 ℃;檢測波長:210、254、290 和348 nm;采用色譜峰面積歸一化方法計算四個波長下純度，結果純度均在98%以上。

圖4 HPLC-UV 法L7GU 純度檢查Fig.4 HPLC-UV chromatograms of L7GU at UV detection wavelength of 210 nm (A)，254 nm (B)，290 nm(C)and 348 nm (D)

3 討論

采用高壓液相制備色譜法分離提純化合物一般存在設備昂貴、操作要求高、隨著上樣量的增加柱效急劇降低等問題［11］。使用一般的中壓制備色譜系統分離提純化合物雖然具有上樣量大的優點，但是往往在運行幾次后，分離效能下降明顯，其主要原因是填料松動造成填料不均勻甚至產生所謂“壁流”現象。本實驗采用的色譜塔兩端具有特殊的錐形接口設計，可以容易的使物料填實，因而不需要額外的動態壓縮裝置即可以保證裝柱及運行過程中色譜塔內填料的緊密，防止大容量中壓色譜柱常見的“壁流”現象發生，因而保證了良好的柱效，并且因為采用耐壓玻璃，可以直接觀察設備運行情況，特別對帶有顏色信息物質的提純分離十分方便。與高壓液相制備色譜系統相比，此中壓分離系統操作更簡便、產量大、運行成本低，非常適合用于天然產物的大量制備與純化。

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