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柴胡屬植物HPLC 指紋圖譜及聚類分析

2014-01-09 07:38:50王書林
天然產物研究與開發 2014年5期

王 硯,王書林

1成都中醫藥大學藥學院,成都 611137;2 四川省食品藥品檢驗檢測院,成都 611731

我國柴胡屬植物分布廣,種類多,有36 種、17變種、7 變型,但《中國藥典》2010 年版僅收載了北柴胡(Bupleurumchinense DC.)和狹葉柴胡(Bupleurumscorzonerifolium Willd.)兩個來源[1],其資源遠遠不能滿足市場需求。竹葉柴胡(Bupleurummarginatum Wall.exDC.)在中國西南地區分布廣泛,具有悠久的用藥歷史,是目前市場上柴胡藥材的主要來源之一,但并非為藥典正品柴胡,故不能作為柴胡藥材在制劑生產中投料,在市場應用上受到一定限制。本文選擇竹葉柴胡(B.marginatumWall.exDC.)進行研究,首先利用中國藥典正品柴胡樣品(北柴胡)建立標準指紋圖譜,將其與標準指紋圖譜進行相似度比較,以評估其內在質量,考察其作為柴胡資源補充的可能性。同時增加其他幾種基源如馬尾柴胡(B.microcephalum Diels.)、馬爾康柴胡(B.malconense Shan et Y.Li.)、抱莖柴胡(Bupleurumlongicaule var.amplexicaule C.Y.Wu),通過相似度結果評價不同基源的柴胡質量的一致性和差異性,再進行聚類分析,考察各不同基源柴胡親緣關系,驗證聚類分析方法作為基源鑒定的可行性,為柴胡基源鑒定提供科學依據,并可用于選育優質的柴胡品種。

據報道,竹葉柴胡的化學成分主要為五環三萜類齊墩果烷型衍生物,含量較高的為柴胡皂苷a、c、d[2],現代藥理研究表明柴胡皂苷具有解熱、抗炎、保肝、免疫調節、抗腫瘤以及鎮靜、抗驚厥等多方面藥理活性[3-6]。《中國藥典》2010 年版柴胡項下鑒別和含量測定成分為柴胡皂苷a、d,功能與主治為疏散退熱,疏肝解郁,升舉陽氣。竹葉柴胡的化學指標成分及藥理作用跟藥典正品柴胡具有一致性,但竹葉柴胡習慣以全草入藥,目前對于竹葉柴胡的研究亦均為全草,而藥典收載的柴胡品種以根入藥,故對竹葉柴胡根部的化學成分研究缺乏針對性。故本文所用樣品均為干燥根部分,著力于闡明竹葉柴胡與北柴胡干燥根在內在成分上的相關性以及竹葉柴胡作為藥典正品柴胡的補充資源的可行性。

1 材料與儀器

1.1 材料與試劑

不同基源柴胡藥材于2011~2013 年期間8 月~9 月采自四川省榮縣、綿陽、阿壩州地區、河北承德和陜西鳳縣,共13 份,編號、基源見表1。供建立標準指紋圖譜的北柴胡樣品于2011~2013 年期間8 月~9 月采自河北涉縣、綿陽青川、河北承德、陜西鳳縣四川劍閣和河北安國,共10 份,編號、基源見表2。以上樣品均由四川省食品藥品檢驗檢測院黎躍成主任藥師鑒定。

表1 柴胡藥材樣品Table 1 Information of Bupleurum samples investigated in this study

表2 建立標準指紋圖譜的北柴胡藥材樣品Table 2 Information of B.chinense DC.samples for standard fingerprinting

柴胡皂苷A(批號:110777-201108)、柴胡皂苷D(批號:110778-201208)對照品均來源于中國藥品生物制品檢定所;柴胡皂苷B2(批號:12041002)、柴胡皂苷C(批號:12091701)對照品來源于通羅馬科技有限公司。乙腈,色譜純,購自Fisher 公司;試劑均為分析純。

1.2 儀器

Waters2695 高效液相色譜儀-Waters2487 紫外檢測器(美國Waters 公司),Empower 工作站;FB11207 超聲處理儀(Fisherbrand);150 搖擺式粉碎機(浙江瑞安永歷制藥機械有限公司);CPA2250 電子天平(賽多利斯科學儀器有限公司);SEG-021H高溫試驗箱(上海愛斯佩克環境設備有限公司)

2 實驗方法

2.1 供試品溶液和對照品溶液的制備

分別精密稱取適量柴胡皂苷A、B2、C、D 對照品,置10 mL 容量瓶中,用適量甲醇溶解后定容至刻度并搖勻,分別制成濃度為1.04、0.62、0.68 和1.04 mg/mL 的混合對照品溶液。

稱取樣品粉末(過四號篩)約0.5 g,精密稱定,置具塞錐形瓶中,加入含5%濃氨試液的甲醇溶液25 mL,密塞,30 ℃超聲處理(功率200 W,頻率40 kHz)30 min,濾過,用甲醇20 mL 分2 次洗滌容器及藥渣,洗液與濾液合并,回收溶劑至干。殘渣加甲醇溶解,轉移至5mL 量瓶中,加甲醇定容至刻度,搖勻,濾過,取續濾液,即得。

2.2 HPLC-UV 分析條件

色譜柱:Welch C18色譜柱(4.6 mm ×250 mm,5 μm);流動相為乙腈(A)和水(B);梯度洗脫條件為0~50 min,25%~90%A;檢測波長為210 nm;柱溫35 ℃;流速為0.8 mL/min;進樣量為10 μL。

2.3 方法學驗證

2.3.1 精密度試驗

取2.1 中供試品溶液在2.2 液相色譜條件下,連續進樣5 次,測定各共有色譜峰的保留時間和峰面積,以柴胡皂苷D 為參照峰,計算相對保留時間和相對峰面積的RSD,結果表明相對保留時間RSD在0.045%~0.98%,相對峰面積的RSD 在0.28%~1.11%,表明儀器精密度良好。

2.3.2 穩定性試驗

取2.1 中供試品溶液分別于制備后0、8、16、24、48 h 進樣,測定各共有峰的保留時間和峰面積,以柴胡皂苷D 為參照峰,計算相對保留時間和峰面積的RSD 值,結果表明相對保留時間RSD 為0.056%~1.22%,相對峰面積的RSD 在0.98%~2.65%,說明樣品在48h 內穩定。

2.3.3 重復性試驗

取S1 樣品5 份,按供試品溶液制備方法制備供試品溶液,分別進樣,測定各共有峰的保留時間和峰面積,以柴胡皂苷A 為參照峰,計算相對保留時間和相對峰面積的RSD 值,結果表明相對保留時間RSD 為0.033%~2.01%,相對峰面積的RSD 為1.08%~2.39%,說明該方法重復性良好。

2.4 樣品分析

將表1 中18 批柴胡樣品按2.1 項下方法制備所得供試液按2.2 項下色譜條件進樣分析,記錄色譜圖,同時定位柴胡皂苷A、柴胡皂苷B2、柴胡皂苷C 和柴胡皂苷D。

2.5 數據處理

將表2 中10 批北柴胡樣品(分別采自陜西鳳縣、河北涉縣、河北承德、綿陽青川和河北安國)HPLC 色譜圖導入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統》,生成北柴胡對照圖譜。再以北柴胡對照圖譜為參照圖譜,將表1 中13 批柴胡樣品HPLC 色譜圖導入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統》,計算相似度。

以共有峰峰面積為變量,運用SPSS 18.0 軟件對各樣品進行聚類分析,得出樹形圖。

3 實驗結果

3.1 北柴胡標準指紋圖譜的建立

按2.2 項下色譜條件對表2 中北柴胡樣品進行檢測,記錄色譜圖50 min 并導入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統2004》,進行色譜峰匹配,匹配數據顯示14 個峰是所有樣品共有的,按出峰時間依次標定為1~14 號峰。見圖1。通過與對照品圖譜比較鑒定,第3、6、9 號峰分別為柴胡皂苷C、柴胡皂苷A 和柴胡皂苷D,未檢出柴胡皂苷B2,選擇6 號峰為參照峰。

圖1 北柴胡HPLC 對照指紋圖譜Fig.1 HPLC chromatogramofB.chinense

3.2 指紋圖譜的相似度計算

按照國家藥典委員會公布的中藥指紋圖譜評價軟件計算方法,得到各批次柴胡的HPLC 指紋圖譜相似度結果見表2,各批次柴胡樣品色譜重疊圖見圖2。從表2 可知,13 批柴胡樣品的相似度均高于0.8,與藥典正品北柴胡相比較,不同基源的柴胡均具有較高的相似性。其中8 批栽培竹葉柴胡相似度在0.877~0.925 之間,兩批野生品種相似度分別為0.941 和0.932,因此同基源藥材由于生長環境不同,指紋圖譜相似度也有所差異,野生竹葉柴胡相似度高于栽培竹葉柴胡,10 批竹葉柴胡平均相似度為0.908;馬爾康柴胡、馬尾柴胡相似度分別為0.915和0.900,說明同為川產道地品種的柴胡與竹葉柴胡化學成分相似度高,基源上較為接近;抱莖柴胡為0.858;

相似度從高到低依次為:竹葉柴胡>馬爾康柴胡>馬尾柴胡>抱莖柴胡。結果顯示,竹葉柴胡與北柴胡化學成分具有較高一致性,并且質量穩定可控。

3.3 聚類分析

根據各色譜峰的峰面積進行系統聚類,結果見圖3。由以下樹狀圖可以看出,聚類距離為1 時S12、S13、S1、S10、S11、S8、S9、S6、S7、S5 聚為一類均為竹葉柴胡,S2(馬爾康柴胡)、S4(馬尾柴胡)在聚類距離為2 時聚為一類,聚類距離為3 時再與S3(抱莖柴胡)聚為一類,聚類距離為4 時與竹葉柴胡聚為一類,說明馬爾康柴胡、馬尾柴胡、抱莖柴胡與竹葉柴胡基源相近。B9、B10、B4、B6、B7 在聚類距離為1 是聚為一類,均為采自陜西鳳縣的北柴胡,B1、B8 為采自河北的北柴胡栽培品種,在聚類距離為2 時聚為一類,再與B2、B5、B3 分別在聚類距離為5、7、12 時聚為一類,北柴胡采收地點相差較大,說明不同的生長環境會導致化學成分的差異較大。

表3 柴胡藥材樣品HPLC 指紋圖譜的相似度結果Table 3 Similarities of Bupleurum samples

圖2 柴胡藥材樣品HPLC 色譜重疊圖Fig.2 Overlapped HPLC chromatograms of Bupleurum samples

圖3 柴胡屬植物的聚類樹狀圖Fig.3 Dendrogram of Bupleurum samples

4 討論

從指紋圖譜分析來看,13 批柴胡樣品相似度結果均高于0.8,竹葉柴胡樣品相似度平均為0.908,說明竹葉柴胡與藥典正品北柴胡物質基礎相近,且質量可控。竹葉柴胡可作為優質柴胡資源進一步研究,以補充藥典收載的品種基源。

聚類分析的結果顯示竹葉柴胡聚為一類,馬爾康柴胡與馬尾柴胡聚為一類,抱莖柴胡聚為一類,以上三種川產柴胡與竹葉柴胡基源最為接近,北柴胡聚為一類。聚類分析與傳統基源分類結果一致,因此聚類分析能夠對不同基源的柴胡進行分類鑒定。

柴胡屬植物種類多,變種、變型多,紛繁復雜,傳統基源鑒別主要依賴植物的地上部分形態特征,對于僅使用根部的柴胡藥材,鑒別其藥材及飲片難度較大。使用HPLC 指紋圖譜可全面地得到柴胡藥材的皂苷類成分化學信息,并利用這些化學信息可對其進行相似度計算進行有效的質量控制。再結合聚類分方法,可從基源上篩選優質可靠的柴胡品種進行培育,緩解藥典正品柴胡供不應求的市場壓力。

1 Chinese Pharmacopoeia Commission(國家藥典委員會).Pharmacopoeia of People’s Republic of China(中華人民共和國中國藥典).Beijing:China Medical Science Press,2010.Vol I,263-264.

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3 Liu YC(劉永春),Cong PC(叢培臣).The study verview for Chemical composition and pharmacological effects ofBupleurum.J Heilongjiang Med(黑龍江醫藥),2006,3:216-218.

4 Xie DH(謝東浩),Cai BC(蔡寶昌),An YQ(安益強),et al.Study progress of chemical constituents and pharmacological effects for Saikosaponin.J Nanjing Univ Trad Chin Med(南京中醫藥大學學報),2007,23:63-65.

5 Yang RM(楊潤梅),Gao NN(高南南).Research of the effects of Bupleurumfor four different models of kidney disease.Chin J Mod Med(中國現代實用醫學雜志),2006,5:41-44.

6 Yang ZG(楊志剛),Chen AQ(陳阿琴),Sun HX(孫紅祥),et al.Progress of pharmacological effects of Saikosapo-nin.Chin J Veterin Drug(中國獸藥雜志),2005,39:27-30.

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