制何首烏提取物及主要單體成分體外對酪氨酸酶活性的影響

石璐緣，李登科，崔寶弟，付 瑩，馮光遠(yuǎn)，趙 晨，孫震曉

北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院生物制藥系，北京 100102

何首烏始載于《開寶本草》，為蓼科植物何首烏(Polygonum multiflorum Thunb.)的干燥塊根，根據(jù)炮制與否其功效大有不同，生用可解毒、消癰、潤腸通便，制何首烏則具有補肝腎、益精血、烏須發(fā)等功效［1］。制何首烏作為一種傳統(tǒng)的烏發(fā)良品廣為人知，《本草綱目》贊其“養(yǎng)血益肝，固精益腎，健筋骨，烏髭發(fā)，為滋補良藥”，且在八寶丹、神仙烏云丹等烏發(fā)古方中均有收錄。然而制何首烏功善烏發(fā)的作用機制目前尚不明確。

白發(fā)的病因與發(fā)病機理復(fù)雜，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究認(rèn)為，可能與遺傳、衰老、疾病等導(dǎo)致的黑素干細(xì)胞衰老、黑素細(xì)胞減少等有關(guān)，機制包括bcl-2 基因缺失、氧化損傷、氧化應(yīng)激、微量元素缺乏等，其中，酪氨酸酶(tyrosinase)表達(dá)量減少或活性降低是一個重要的因素［2，3］。酪氨酸酶是體內(nèi)黑素合成的主要限速酶，酪氨酸酶活性降低將使體內(nèi)黑素合成的反應(yīng)進(jìn)行得十分緩慢［4］。目前研究表明，何首烏的主要成分有蒽醌類化合物、二苯乙烯苷類化合物、磷脂和微量元素等［5］，本實驗選用制何首烏不同分離部位及其所含主要單體成分進(jìn)行實驗，考察制何首烏是否是通過某種分離部位或有效單體成分直接激活酪氨酸酶的催化活性從而促進(jìn)黑素的合成，為進(jìn)一步研究制何首烏烏發(fā)機制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

制何首烏藥材購自北京同仁堂飲片有限責(zé)任公司，批號701001037，產(chǎn)地為湖北，由北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院中藥生藥系張貴君教授鑒定;蘑菇酪氨酸酶(tyrosinase)，L-多巴，均購自美國Sigma 公司;丙二醇，乙酸乙酯試劑均為分析純;2，3，5，4'-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷(2，3，5，4'-tetrahydroxystilbene-2-O-β-D-glucoside ;THSG)，大黃素(Emodin)，大黃素甲醚(Physcion)，大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷(Emodin-8-O-β-D-glucoside)為標(biāo)準(zhǔn)品，購自中國藥品生物制品檢定所。

酶標(biāo)儀(Spectra Max190，美國分子儀器公司)。

1.2 方法

1.2.1 制何首烏提取分離物制備方法

參照文獻(xiàn)［6］，取制何首烏飲片200 g，用70%乙醇(V/V)提取2 次，第1 次加10 倍量溶劑，提取2 h，第2 次加8 倍量溶劑，提取1.5 h，合并2 次乙醇提取液，回收溶劑至無醇味，加水分散，通過AB-8型大孔樹脂吸附，依次用水、50%乙醇、95%乙醇洗脫至洗脫液無色，分別收集各洗脫液，減壓回收溶劑至干，殘留物減壓干燥，分別得到制何首烏水洗脫物(water eluted extract of processed Polygonum multiflorum，PW)，50%乙醇洗脫物(50% ethanol eluted extract of processed Polygonum multiflorum，P50)，95%乙醇洗脫物(95% ethanol eluted extract of processed Polygonum multiflorum，P95)。另制何首烏飲片200 g，水煎煮提取，第1 次加10 倍量水，提取2 h，第2次加8 倍量水，提取1.5 h，合并兩次水煎液，水浴蒸干，減壓干燥，得制何首烏水提物(water extract of processed Polygonum multiflorum，PWE)。

1.2.2 制何首烏提取物及受試單體溶液配制

根據(jù)提取物及受試單體成分溶解性不同溶解方式及測定體系有所不同。水溶性成分如制何首烏水提物(PWE)，制何首烏水洗脫物(PW)，制何首烏50%乙醇洗脫物(P50)，2，3，5，4'-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷(THSG)用去離子水溶解至受試濃度。脂溶性成分如制何首烏95% 乙醇洗脫物(P95)，大黃素，大黃素甲醚，大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷需以混合溶劑(V丙二醇:V乙酸乙酯=9∶1)溶解至受試濃度。

1.2.3 測定方法

1.2.3.1 制何首烏中各水溶性成分對酪氨酸酶活性影響測定

［7］，采用蘑菇酪氨酸酶多巴速率氧化法測定酪氨酸酶活性。取96 孔板酶標(biāo)板，反應(yīng)物共0.2 mL，37 ℃孵育10 min 后，加0.15% L-多巴0.1 mL，再孵育2 min，用酶標(biāo)儀于475 nm 處測定吸光度A 值(A475)。每種藥物濃度實驗均重復(fù)至少三次。

每種藥物均分為4 組，其中

a 組為:PH6.8 磷酸鹽緩沖液0.19 mL，蘑菇酪氨酸酶0.01 mL(200 u/mL)。

b 組為:PH6.8 磷酸鹽緩沖液0.2 mL。

c 組為:PH6.8 磷酸鹽緩沖液0.18 mL，蘑菇酪氨酸酶0.01 mL(200 u/mL)，藥物0.01 mL。

d 組為:PH6.8 磷酸鹽緩沖液0.19 mL，藥物0.01 mL。

按以下公式計算藥物對酪氨酸酶的激活率。

其中ABCD 分別為abcd 四組的吸光度值。

1.2.3.2 制何首烏中脂溶性成分對酪氨酸酶活性影響測定

參考文獻(xiàn)［8］，取96 孔板酶標(biāo)板，反應(yīng)物共0.15 mL，室溫孵育10 min 后，加0.15% L-多巴0.07 mL，室溫孵育15 min，用酶標(biāo)儀于490 nm 處測定吸光度A 值(A490)。每種藥物濃度實驗均至少重復(fù)三次。

每種藥物均分為4 組，其中

a 組為:PH6.8 磷酸鹽緩沖液0.13 mL，蘑菇酪氨酸酶0.01 mL(200 u/mL)，混合溶劑0.01 mL(V丙二醇:V乙酸乙酯=9∶1)。

b 組為:PH6.8 磷酸鹽緩沖液0.14 mL，混合溶劑0.01 mL(V丙二醇:V乙酸乙酯=9∶1)。

c 組為:PH6.8 磷酸鹽緩沖液0.13 mL，蘑菇酪氨酸酶0.01 mL(200 u/mL)，藥物0.01 mL。

d 組為:PH6.8 磷酸鹽緩沖液0.14 mL，藥物0.01 mL。

按以下公式計算藥物對酪氨酸酶的激活率。

其中ABCD 分別為abcd 四組的吸光度值。

2 結(jié)果與討論

2.1 制何首烏水溶性成分對酪氨酸酶活性的影響

按1.2.3.1 方法進(jìn)行酪氨酸酶活性影響測定，結(jié)果如表1 所示。其中，每1 g 制何首烏水提物(PWE)相當(dāng)于6.272 g 生藥，1 g 制何首烏水洗脫物(PW)相當(dāng)于18.0 g 生藥，1 g 制何首烏50%乙醇洗脫物(P50)相當(dāng)于21.6 g 生藥。表1 中藥物濃度均為實用受試藥物濃度。

表1 制何首烏水溶性成分對酪氨酸酶活性的激活率(，n≥3)Table 1 The activation rate of water-soluble extracts from processed Polygonum multiflorum on tyrosinase activity

表1 制何首烏水溶性成分對酪氨酸酶活性的激活率(，n≥3)Table 1 The activation rate of water-soluble extracts from processed Polygonum multiflorum on tyrosinase activity

注:與空白對照組比較，* P ＜0.05;＊＊P ＜0.01;＊＊＊P ＜0.001。Note:Compare with control，* P ＜0.05;＊＊P ＜0.01;＊＊＊P ＜0.001.

由表1 中可見，制何首烏各水溶性成分激活率結(jié)果均為負(fù)值，說明制何首烏各水溶性成分對酪氨酸酶無激活作用，反而不同程度濃度呈依賴性地抑制酪氨酸酶活性，其中，制何首烏50%乙醇洗脫物(P50)，制何首烏水提物(PWE)，2，3，5，4'-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷(THSG)在高濃度水平下均對酪氨酸酶產(chǎn)生了顯著的抑制效果，如P50 在0.5 mg/mL 濃度下，對酪氨酸酶活性抑制率為48.71 ±10.21%，PWE 在3.9 mg/mL 濃度下，對酪氨酸酶活性抑制率為51.75 ±9.92%，而THSG 在48 μg/mL 濃度下，對酪氨酸酶活性抑制率可達(dá)46.72±5.49%，但PW 在最高實驗濃度6 mg/mL 下對酪氨酸酶活性卻無明顯影響。

2.2 制何首烏脂溶性成分對酪氨酸酶活性影響結(jié)果

按1.2.3.2 方法進(jìn)行酪氨酸酶活性影響測定，結(jié)果如表2 所示。其中，每1 g 制何首烏95%乙醇洗脫物(P95)相當(dāng)于909.1 g 生藥。表2 中藥物濃度均為實用受試藥物濃度。

表2 制何首烏脂溶性成分對酪氨酸酶活性的激活率(，n≥3)Table 2 The activation rate of liposoluble components from processed Polygonum multiflorum on tyrosinase activity

表2 制何首烏脂溶性成分對酪氨酸酶活性的激活率(，n≥3)Table 2 The activation rate of liposoluble components from processed Polygonum multiflorum on tyrosinase activity

注:與空白對照組比較，* P ＜0.05;＊＊P ＜0.01;＊＊＊P ＜0.001。Note:Compare with control，* P ＜0.05;＊＊P ＜0.01;＊＊＊P ＜0.001.

由表2 可見，在制何首烏脂溶性各成分中，無體外條件下有效激活酪氨酸酶活性的成分，大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷與大黃素甲醚對酪氨酸酶活性均無明顯影響，但0.5 mg/mL 的大黃素對酪氨酸酶有26.93 ±17.91%的顯著抑制作用，3.65 mg/mL 的制何首烏95% 乙醇洗脫物對酪氨酸酶有37.89 ±9.94%的極顯著抑制作用，且抑制作用呈明顯的濃度依賴性。

2.3 討論

在人體內(nèi)，黑素的合成主要先由酪氨酸羥化生成多巴，多巴氧化生成多巴醌，二羥基吲哚轉(zhuǎn)化生成吲哚醌，這些反應(yīng)步驟均需酪氨酸酶參與［4］。酪氨酸酶是黑素生成的主要限速酶，在黑色素生成過程中起著至關(guān)重要的作用，其化學(xué)結(jié)構(gòu)為銅結(jié)合糖蛋白。有研究認(rèn)為何首烏的蒽醌衍生物對酪氨酸酶活性存在顯著的促進(jìn)作用［9］，2，3，5，4'-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷能夠有效激活黑色素瘤細(xì)胞內(nèi)酪氨酸酶的活性及酪氨酸酶相關(guān)基因的表達(dá)［10］，這些皆可能為何首烏烏發(fā)的作用機制。本實驗結(jié)果表明，大黃素，大黃素甲醚，大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷，2，3，5，4'-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷等制何首烏主要單體成分及制何首烏各分離部位在體外條件下均無酪氨酸酶激活作用，而制何首烏水提物、制何首烏乙醇提取物的50%乙醇洗脫物及95%乙醇洗脫物、2，3，5，4'-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷、大黃素等皆表現(xiàn)出了一定的酪氨酸酶抑制活性。由結(jié)果看來，制何首烏脂溶性成分中大黃素可能起到了主要的抑制作用。何冰芳［11］等的研究也顯示，大黃素對酪氨酸酶有顯著的競爭性抑制作用，50%抑制率的藥物濃度為36.6 μg/mL，與本實驗的研究結(jié)果一致。目前已報道的何首烏烏發(fā)機制研究多從酪氨酸酶活性及表達(dá)量等切入，如姜澤群［12］等人研究認(rèn)為，何首烏可通過上調(diào)B16 黑素瘤細(xì)胞內(nèi)的酪氨酸酶表達(dá)量及酪氨酸酶活性促進(jìn)黑素的生成，但根據(jù)對制何首烏各成分體外對酪氨酸酶活性影響的實驗結(jié)果，并未篩到激活酪氨酸酶活性成分。雖然我們目前的體外研究數(shù)據(jù)不支持制何首烏可以通過激活酪氨酸酶活性發(fā)揮烏發(fā)作用，制何首烏及其體內(nèi)代謝物作用于黑素細(xì)胞后對酪氨酸酶活性的影響尚待進(jìn)一步研究確定。制何首烏是否可能通過其他途徑促進(jìn)黑素細(xì)胞中黑素的生成，或通過抗氧化損傷保護(hù)黑素干細(xì)胞以及黑素細(xì)胞從而保證黑素的正常合成，抑或通過其他機制產(chǎn)生烏發(fā)效果還有待進(jìn)一步研究。

值得一提的是，酪氨酸酶的活性研究同樣是美白制劑研發(fā)的重點，酪氨酸酶活性降低可減少肌膚產(chǎn)生的黑色素，從而達(dá)到美白的效果［13］。本實驗發(fā)現(xiàn)，在體外條件下，2，3，5，4'-四羥基二苯乙烯-2-Oβ-D-葡萄糖苷在48 μg/mL 極低濃度下即可產(chǎn)生46.72 ±5.49%的酪氨酸酶抑制效果，達(dá)到極顯著水平，可見其具有美白的潛在功效。目前常用于皮膚美白添加劑的有曲酸及其衍生物，果酸，維生素C等，這些美白添加劑各自都存在一定的副作用，如曲酸及其衍生物穩(wěn)定性差且長期使用仍有細(xì)胞毒性，果酸中的主要成分α-羥基酸則易導(dǎo)致曬傷甚至皮膚癌，維生素C 皮膚吸收性差且不穩(wěn)定。開發(fā)穩(wěn)定、低毒的天然酪氨酸酶抑制劑美白產(chǎn)品具有廣闊的前景。2，3，5，4'-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷為植物源的純天然提取物，水溶性強，細(xì)胞毒性小(未發(fā)表結(jié)果)，且班翊［14］等對其穩(wěn)定性進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)二苯乙烯苷在中性及弱堿性水溶液中30 d 含量無明顯變化，穩(wěn)定性好，另外，呂麗爽等［15］采用聚酰胺柱層析系統(tǒng)及溶劑結(jié)晶技術(shù)，開發(fā)出了工藝簡單，成本低，可工業(yè)化分離二苯乙烯苷的方法，純度可達(dá)99% 以上，這些都為2，3，5，4'-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷在美白領(lǐng)域的研發(fā)奠定了基礎(chǔ)，值得重視。

參考文獻(xiàn)

1 Chinese Pharmacopoeia Commission(國家藥典委員會).Pharmacopoeia of the People’s Republic of China(中華人民共和國藥典).Beijing:China Medical Science Press，2010.Vol Ⅰ，195-197.

2 Fu QX(付慶霞)，Wang HP(王海蘋).Research situation of the etiology and pathogenesis of poliosis.Guangming J Chin Med(光明中醫(yī))，2009，24:375-377.

3 Ken I，Takahiro A，Nguyen TB，et al.Genotoxic stress abrogates renewalof Melanocyte stem cells by triggering their differentiation.Cell，2009，137:1088-1099.

4 Prota G.Progress in the chemistry of melanin and related metabolites.Med Res Rev，1988，8:525-556.

5 Zhang C(張超)，Sun ZX(孫震曉).Advance in studies on the chemical constituent of Polygonum multiflorum and its metabolism in vivo.Mianyang:The biochemical and biotech drugs academic convention(全國生化與生物技術(shù)藥物學(xué)術(shù)年會)，2010:130.

6 Zhang RC(張瑞晨)，Liu B(劉斌)，Sun ZX(孫震曉)，et al.Effects of extract of Polygonummultiflorum on cell cycle arrest and apoptosis of human liver cell line L02.J Chin Integrative Med(中西醫(yī)結(jié)合學(xué)報)，2010，8:554-561.

7 Lou CX(樓彩霞)，Pu XL(樸香蘭).The reaction system for the study of forsythia suspensa on tyrosinase inhibitory effect.Lishizhen Med Mater Med(時珍國醫(yī)國藥)，2011，22:2580-2582.

8 Zhou Z(周中)，Wang JG(王建國)，Zhou L(周蕾)，et al.A testing method for evaluation of inhibitory performance of oil soluble lighteners against tyrosinase.Chin Surfactant Detergent ＆ Cosmetics(日用化學(xué)工業(yè))，2003，33:326-328.

9 Yang TC(楊同成).Preliminary Explore of the Extraction and Anti-white Hair Mechanism of Anthraquinone Derivative of Polygonum multiflorum Thumb.J Fujian Normal Univ(福建師范大學(xué)學(xué)報)，1993，9(2):66-69.

10 Jiang ZQ，Xu JM，Long MH，et al.2，3，5，4'-tetrahydroxystilbene-2-O-β-D-glucoside(THSG)induces melanogenesis in B16 cells by MAP kinase activation and tyrosinase upregulation.Life Sci，2009，85:345-350.

11 He BF(何冰芳)，Chen QH(陳瓊?cè)A).Inhibitory effects of anthraquinone derivatives of Chinese Rhub Arb on tyrosinase.Biochem J(生物化學(xué)雜志)，1989，5:154-158.

12 Jiang ZQ(姜澤群)，Wu Q(吳瓊)，Xu JM(徐繼敏)，et al.Promotion of melanin production by Radix Polygoni Multiflori:pA Study of Its Mechanism.J Nanjing Univ Trad Chin Med(南京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報)，2010，26:190-192.

13 Guan XL(官興麗)，Luo LY(羅理勇)，Zeng L(曾亮)，Advances at the research on the skin lightening effect and mechanism of natural products.Sci Tech Food Ind(食品工業(yè)科技)，2011，32:432-436.

14 Ban Y(班翊)，Liu QL(劉其禮)，Jin Y(金悠)，et al.Determination of stilbene-glucoside and investigation on its stability.Chin Tradit Herb Drugs(中草藥)，2004，35:1235-1237.

15 Lu LS(呂麗爽)，Tang J(湯堅)，He QT(何其儻).Preparation and antioxidation mechanism of stilibene glycoside from Polygonum multiflorum Thunb.Wuxi:Jiangnan University(江南大學(xué))，PhD.2006.