特應性皮炎小鼠模型建立方法的研究

張麗霞，王 倩，陳 金，盧 葳，蔡 震

(四川省醫學科學院·四川省人民醫院a.皮膚病性病研究所，b.整形外科，四川 成都610072)

特應性皮炎(atopic dermatitis，AD)作為一種慢性復發性、瘙癢性、炎癥性皮膚病，發病率呈逐年上升趨勢，是常見的難治性皮膚病之一，嚴重影響患者及其家屬的生活質量。隨著人們對AD 研究的不斷深入，動物模型逐漸成為研究AD 的發病機理及探索其治療手段的不可缺少的工具，故AD 動物模型的開發和確立，對研究其發病機制和治療具有重要意義。2011 年9 月至2012 年3 月我們通過外用2，4-二硝基氟苯(DNFB)丙酮/橄欖油溶液致敏與激發BALB/c 小鼠，探索AD 模型的建立方法。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與主要試劑 6 ～8 w 的SPF 級純系雌性BALB/c 小鼠16 只，體重約為22 g，由四川省人民醫院實驗動物中心提供，并由該中心工作人員飼養，房間環境控制在溫度23 ～25 ℃，相對濕度50% ～60%，晝夜時間控制在各12 h。2，4-二硝基氟苯(DNFB)購于Sigma 公司。小鼠IL-4、IFN-γ 及IgE ELISA 檢測試劑盒購于上海森雄科技實業有限公司(進口分裝)。

1.2 AD 模型的建立 將16 只小鼠隨機分為對照組和模型組，每組8 只。皮損誘導參考Wu 等［1］的AD 小鼠模型的建立方法略有改進:實驗前1 周用8%硫化鈉淀粉溶液脫去兩組小鼠背部體毛，面積約2.5 cm×2.5 cm。實驗第1 天和第2 天模型組小鼠皮損致敏與激發用0.5%DNFB 以及丙酮/橄欖油(3︰1)混合溶液各涂搽一次小鼠背部脫毛區，每次100 μl，第3 ～6 天不作處理，第7 天始每隔2 天涂搽一次，每次70 μl，第28 天涂搽后造模完成，共涂搽10 次。對照組小鼠背部脫毛區僅涂搽丙酮/橄欖油(3︰1)溶液，涂搽時間及涂搽劑量與模型組一致。

1.3 觀察指標 ①搔抓行為:建模完成后，將小鼠單獨放置，觀察10 min 內小鼠搔抓背部次數，連續搔抓算作一次。②皮損表現:觀察各組小鼠皮損表現情況并拍照。③血清IL-4、IFN-γ 及IgE 濃度檢測:模型建立成功后，模型組及對照組小鼠經腹腔注射10%水合氯醛(1 ml/kg)麻醉后，摘除右側眼球取血，37 ℃靜置30 min，3500 r/min 離心15 min，收集血清，應用酶聯免疫吸附試驗，使用小鼠IL-4、IFN-γ 及IgE ELISAKit，按照說明書指示操作。④組織病理檢查:無菌條件下取兩組小鼠皮損組織，以10%甲醛液固定。常規石蠟包埋、切片，用蘇木精-伊紅染色后，顯微鏡下觀察組織病理改變。

1.4 統計學方法 采用SPSS 17.0 統計軟件包對數據進行統計學分析。計量資料用均數±標準差表示，比較用t檢驗，按照檢驗水準α=0.05，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 搔抓行為 模型組小鼠10 分鐘內搔抓行為次數(12.63±2.2)次，對照組(1.25±1.04)次，模型組小鼠10 分鐘內搔抓行為次數顯著高于對照組(t=13.234，P＜0.05)。

2.2 局部皮膚表現及皮膚組織病理變化 對照組小鼠皮膚表現正常，組織結構基本正常，未見明顯炎性細胞浸潤;模型組小鼠皮膚可見紅斑、丘疹、結痂、苔蘚樣變等皮損改變，鏡下可見角化過度伴角化不全，棘層肥厚，棘細胞間海綿水腫，真皮淺層可見以淋巴細胞為主的慢性炎細胞浸潤(圖1、圖2)。

圖1 兩組局部皮膚表現 a:模型組;b:對照組圖2 兩組皮膚組織病理變化(HE 染色，×100) a:模型組;b:對照組

2.3 血清IL-4、IFN-γ 及IgE 濃度 模型組小鼠血清IL-4、IFN-γ 及IgE 水平均顯著高于對照組(P＜0.05)，見表1。

表1 模型組和對照組IL-4、IFN-γ 及IgE 血清表達水平比較

3 討論

AD 是一個由Th1/Th2 免疫反應引發的雙相性炎癥性皮膚病［2］。Thl/Th2 細胞通過分泌不同的細胞因子而發揮免疫作用，Th1 細胞亞群主要產生IL-2、INF-γ 等細胞因子，Th2 細胞亞群則主要產生IL-4、IL-13 等細胞因子［3］。在AD 急性期的皮損及循環血液中均可呈現IL-4、IL-13 等細胞因子表達增高和IFN-γ 表達降低，Th2 細胞占優勢。在AD 慢性期，雖然皮損及循環血液中的細胞因子IL-4、IL-13的水平也高，但較急性期則明顯降低，而此期IFN-γ水平明顯增高，Th1 細胞占優勢［4］。

建立實驗動物模型是我們研究人類各種疾病發生、發展規律，探索新的治療途徑不可缺少的工具及重要的手段，能避免給患者帶來損害及痛苦，并可克服不便于在患者身上試驗的各種人類相關疾病的研究，還可以用單一的病因，在短時間內復制出典型的疾病模型，克服了人類疾病發生發展緩慢、潛伏期長、發病原因多樣及伴有其它各種疾病等因素的干擾。

有關AD 模型的動物選擇方面，1997 年Matsuda等［5］將NC/Nga 鼠作為首個AD 模型鼠作了報告。該小鼠模型與人類AD 的各個方面都極其相似，是公認的能夠較全面反映AD 疾病發展的動物模型，多用于AD 的病理生理方面的研究［6］，但此種小鼠來源困難且價格昂貴。近幾年，人類又建立了一系列AD 的轉基因和基因敲除小鼠模型，其對AD 的發病機制，特別是一些細胞因子的作用有了更深一步的認識［7］。雖然國際上轉基因和基因敲除技術已相當成熟，但國內此項技術才剛起步，還停留在實驗室摸索階段，沒有形成產業化，此種小鼠來源也相當困難。近年來，在AD 模型的建立中，BALB/c 小鼠得到了廣泛使用，BALB/c 小鼠是一個常用的近交系(inbred strain)小鼠品系，中國醫學科學院實驗動物研究所于1985 年從美國NIH 引進。BALB/c小鼠個體之間差異小，遺傳基因純，整體素質好，常用于單克隆抗體和免疫學研究。早在1995 年，Kitagaki 等［8］用1%DNFB 反復涂擦BALB/c 鼠耳部皮膚24 ～48 d 后，發現真皮大量肥大細胞和CD4+T 淋巴細胞浸潤，血清特異性IgE 顯著升高，和AD 患者及其他AD 動物模型相似。之后Spergel 等［9］用卵清蛋白(OVA)制成斑貼致敏無菌條件下的BALB/c小鼠，引發了系統免疫反應和局部皮炎表現，其皮損表現及病理結果與AD 表現一致。

DNFB 丙酮液是一種常見的致敏劑，可致敏和激發動物皮膚出現典型的接觸性皮炎損害，在制作實驗性接觸性皮炎動物模型中被廣泛應用［10，11］，因此本研究應用DNFB 作為致敏劑反復刺激來制備BALB/c 小鼠模型。通過觀察小鼠皮膚變化及其搔抓行為，評價炎性程度，并檢驗外周血內IL-4、IFN-γ及IgE 的含量來判斷模型是否制作成功。本實驗中我們第一次應用DNFB 刺激小鼠除毛的背部后1 周內，局部皮膚未出現任何炎性反應，說明DNFB 對皮膚沒有直接損傷。重復外用DNFB4周，可以引起BALB/c 小鼠明顯的濕疹樣改變，背部出現紅斑、丘疹、滲出、結痂等表現;組織HE 染色顯示鏡下可見角化過度伴角化不全、棘層肥厚、棘細胞間海綿水腫，真皮淺層可見以淋巴細胞為主的慢性炎細胞浸潤;上調血漿中IL-4、IFN-γ 及IgE 的濃度，同時伴有搔抓行為的增加。以上結果顯示采用半抗原DNFB誘導與激發BALB/c 小鼠，模型組小鼠搔抓頻率、皮損表現、組織病理學結果和細胞因子變化都與人類慢性期AD 類似［12］，提示我們AD 慢性期小鼠模型建立成功，此模型為我們進一步研究AD 的發病機理及探索其治療手段提供了有效實驗工具。

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