Cthrc1 及tgf-β1/Smad 與異常纖維化關系的研究進展

周 竹，陳 金

ZHOU Zhu，CHEN Jin

(1.瀘州醫學院臨床醫學院，四川 瀘州646000;2.四川省醫學科學院·四川省人民醫院皮膚病性病研究所，四川 成都610072)

1 三螺旋重復膠原蛋白1(collagen triple helix repeat containing 1，Cthrc1)

1.1 Cthrc1 的蛋白結構 Cthrc1 是一種表達在受損或病態動脈中的新型蛋白。Cthrc1 相對分子質量為28000，它包含一個N 端信號肽、一個包含36 個氨基酸的膠原三螺旋蛋白和一個球狀結構域的C端［1］。Cthrc1 是一種28-KDa 分泌型糖化蛋白，通過免疫印跡分析可見組織溶解產物顯示四Cthrc1 免疫反應性的結合，表明Cthrc1 是可修改或重新組合的，Sengupta 等發現N 端糖基化使Cthrc1 穩定性增加，到目前為止，還不清楚何護蛋白酶參與Cthrc1裂解，裂解事件怎樣影響Cthrc1 的活動［2，3］。Cthrc1在成纖維細胞等多處組織中被發現，Takeshita 等［4］發現Cthrc1 可被成熟破骨細胞分泌，是一個破骨細胞分泌的偶聯因子，也是調節骨重塑的因素之一。

1.2 Cthrc1 基因及表達 Cthrc1 基因最早發現于對大鼠正常主動脈和球狀損傷動脈基因序列差異性的檢測研究［5］，位于8q22.3，基因長度為11 435 bases，其編碼的產物為Cthrc1。Durmus 等發現Cthrc1特征表達域存在于小鼠胚胎發育組織和產后組織。在小鼠胚胎，Cthrc1 基因表達在內臟內胚層、脊索、神經管、發育中的腎和心臟。同時觀測到Cthrc1 在發育中的骨組織、生長板、軟骨組織、骨基質和骨連接中大量表達;成年人的骨骼顯示Cthrc1 的表達只在骨基質和骨連接，而在關節軟骨中缺乏表達;Cthrc1 通常是表達在上皮-間質界面，包括表皮和真皮組織、氣道上皮組織、基底角膜上皮組織、脈絡叢上皮組織、食道上皮細胞及腦膜;在成人腎臟，Cthrc1 表達在收集管和遠端小管［6］。

Cthrc1 基因在不同的組織中表達所表現出的生物學過程及其作用都有所不同。Cthrc1 基因的表達和動脈修復有關，Cthrc1 基因的高表達會顯著降低Ⅰ型膠原蛋白mRNA 及其蛋白的表達水平，其高表達能限制膠原蛋白的沉積，促進細胞的移動從而促進動脈血管再造、修復，這一生物學作用在體外實驗中已被證實［7，8］。有研究表明Cthrc1 蛋白是骨成型蛋白的下游靶點，能增加造骨細胞的數量，加速造骨細胞的造骨作用［9］;Cthrc1 基因產物具有類激素功能包括調節脂質細胞糖原儲存和可能廣泛影響細胞代謝和生理機能水平［10］。國內外大量研究表明Cthrc1 表達在腫瘤的發病及發展中有重要作用。最新有關Cthrc1 與黑色素瘤、直腸癌、肝癌研究均顯示，Cthrc1 基因的表達與腫瘤的大小、TNM 階段及腫瘤的分化成正相關;Cthrc1 低表達的腫瘤患者生存率明顯高于Cthrc1 高表達的患者。Cthrc1 與血管內皮生長因子協同促進人類腫瘤細胞的侵襲轉移，制止Cthrc1 表達可抑制腫瘤細胞的浸潤轉移，相反過表達Cthrc1 將加快腫瘤細胞的浸潤轉移［11～13］。

2 轉化生長因子-β1(transforming growth factorβ1，tgf-β1)與Smad 信號蛋白

2.1 tgf-β1 結構及功能 tgf-β 是新近發現的可調節細胞生長和分化的一組蛋白群tgf-β 超家族中的一員，與創傷愈合、瘢痕形成有密切關系。據目前報道，哺乳動物體內至少發現有tgf-β1、tgf-β2、tgf-β3這3 個亞型。在人體細胞中，tgf-β1 是tgf-β 3 種亞型中所占比例(＞90%)最高的一型，并可由體內多種細胞合成和分泌［14］。tgf-β 與其相應受體結合，調節細胞生物學行為，目前研究較多的tgf-β 受體(transforming growth factor bete receptor，TβR)主要有TβRⅠ、TβRⅡ、TβRⅢ這3 種，其中TβRⅠ、TβRⅡ是tgf-β1/smads 信號轉導必不可少的，TβRⅠ與tgf-β1 結合后產生的生物學作用主要有阻止上皮細胞增殖，促使間質細胞增生，使其向肌纖維細胞轉換，產生大量的膠原;調節免疫活性細胞的表型增殖、分化和細胞因子的產生，進而誘導細胞分化及組織的修復［15］。

tgf-β1 參與組織異常纖維化，在慢性阻塞性肺疾病的發展過程中，tgf-β1 是調控導致氣道平滑肌結構和功能異常的信號的總開關，其作用于成纖維細胞可促進小氣道周圍纖維化的發生發展［16～18］。最新研究表明tgf-β1 表達的變化與人類癌癥有關。在腫瘤前、中期tgf-β1 能抑制腫瘤細胞生長，但在腫瘤晚期則促進腫瘤細胞生長［19，20］，進一步研究發現這可能與腫瘤細胞中TGF-β1 通過激活Smad3 及其下游信號通路而誘導CSRNP1 基因的表達有關［21］。

2.2 Smad 結構及功能 參與tgf-β 信號轉導的來源于動物和人的相關蛋白被Massague 等統一命名為Smad 信號蛋白家族。Smad 信號蛋白家族是tgfβ 與其受體結合后產生的信號中介分子，將其從細胞質轉導到細胞核內［22，23］。目前已發現至少10 種Smad，根據其結構和功能特點分為3 類①受體調節性的Smads(R-Smad):Smad 1、2、3、5、8、9、10，其中參與tgf-β1 信號轉導的是Smad2、3。②共同介導型Smads(Co-Smads):Smad4，可以與所有活化的途徑限制型Smad 蛋白結合，為tgf-β1 信號轉導途徑的共同通路。③抑制型Smad(I-Smads):Smad 6、7，可與活化的TβRⅠ牢固結合，阻止R-Smad 的磷酸化，從而拮抗受體激活的Smad 蛋白介導的信號傳導［24］。三種不同類型的Smad 蛋白之間存在相互協助作用，依賴Smad4 和R-Smad 組成活性復合物，借助一些輔助因子的幫助，進入細胞核內對靶基因表達予以調控;而抑制性Smad 蛋白起到阻止活性復合物形成、確保Smad 蛋白功能正常發揮的作用。Smad 作為tgf-β1 通路的胞內信號蛋白，受到多種信號通路的影響，也能夠廣泛調節多種基因表達［25］。

2.3 tgf-β1/Smad 信號轉導途徑 在tgf-β1 信號傳導途徑中，Smad 蛋白作為其信號轉導通路的始動因子已被大家所公認，其傳導通路也已被闡明。tgfβ1/Smad 信號通路的基本過程為:tgf-β1 首先與TβRⅡ結合，形成tgf-β1/TβRⅡ;TβRⅠ與tgf-β1/TβRⅡ復合物結合，形成tgf-TβRⅠ/TβRⅡ聚合體形式;從而使TβRⅠ磷酸化形成;TβR 被激活后，生物信號傳入細胞內，發揮調節蛋白生成的作用，Smad 蛋白家族起信息傳遞作用;作為tgf-β1 下游蛋白的轉錄因子Smad2 和Smad3 被TβRⅠ磷酸化而激活，從而使Smad2 和Smad3 磷酸化形成。磷酸化的Smad2 結合Smad4 形成聚合體，隨著聚合體轉移到細胞核內，作用于tgf-β1 靶基因發揮信號轉導作用，而Smad3 和Smad4 結合后在胞質核轉運蛋白作用下進入核內，在DNA 連接蛋白協助下發揮調節轉錄的作用或直接作為轉錄因子發揮作用［26］。與此同時，細胞內TβRⅠ負性調節因子絲氨酸/蘇氨酸激酶受體相關蛋白促使Smad6 或Smad7 與活化的TβRⅠ牢固結合，阻止Smad2、Smad3 的磷酸化，而阻斷信號轉導過程。

3 Cthrc1 及tgf-β1/Smad 與異常纖維化的關系

3.1 Cthrc1 與異常纖維化 Cthrc1 是一種新的具有生化活性的基因產物，它具有促進細胞遷移、減少膠原蛋白沉積的作用，與組織異常纖維化相關;研究發現Cthrc1 在瘢痕疙瘩皮損中表達異常，高水平的Cthrc1 表達可能與瘢痕疙瘩侵襲性有關，并促進真皮乳頭血管形成［27］。纖維化是肌營養不良的主要并發癥，Spector 等［28］在模擬杜氏肌營養不良、先天性肌營養不良、神經性肌營養不良患者的小鼠骨骼和心臟肌肉觀測到Cthrc1 的存在，在所有的小鼠中，Cthrc1 與高水平的Ⅰ型膠原蛋白相關，在正常小鼠的肌肉中沒有Cthrc1 或膠原蛋白。在杜氏肌營養不良患者的病理標本中檢測到高水平的Cthrc1及較高水平的Ⅰ型膠原蛋白。運用常三鹵(一種TGF-β 信號下游smad3 蛋白磷酸化抑制劑)干預后，Cthrc1 在模型小鼠的骨骼和心臟肌肉的表達水平明顯降低，在正常成纖維細胞中減少Cthrc1 可增加纖維母細胞的多元化表達和營養不良肌肉被肌纖維入侵，表明Cthrc1 在肌營養不良的主要并發癥纖維化中起著重要作用。

3.2 tgf-β1/Smad 與異常纖維化 tgf-β1/Smads 信號轉導途徑與Ⅰ型膠原蛋白表達有關，正常組織tgf-β1 基因表達的啟動子處于沉默狀態，受到創傷并出現纖維性修復時，通過激活I 型前膠原基因5＇端特異性啟動子的表達，調節相應靶基因轉錄，大量加速I 型前膠原的合成而減少降解，最終導致異常纖維化。Kitao 等［29］用tgf-β1 誘導人的真皮微血管內皮細胞分化時，發現細胞核內磷酸化Smad2 升高，內皮細胞呈現肌成纖維細胞呈梭型的特征及Ⅰ型膠原蛋白表達的增加。tgf-β1/Smad 信號轉導途徑在皮膚纖維化疾病發病機制中起到重要作用。Santiago 等［30］局部使用脂凝膠包被的P144(一種tgf-β 的肽段抑制物)治療皮膚硬化模型鼠可使其皮膚纖維化和可溶性膠原蛋白含量顯著降低;結締組織生長因子的表達及成纖維細胞中Smad2/3 的磷酸化被顯著抑制。通過動物及人體試驗研究表明，A 型肉毒毒素治療瘢痕疙瘩可以明顯減輕患者的頑固性癢痛癥狀，瘢痕也明顯的萎縮扁平，而且進一步的研究發現A 型肉毒毒素這一療效與影響瘢痕組織中tgf-β1 的生成有關［31～33］。現有研究表明tgfβ1/Smad 信號傳導系統與內臟纖維化及腹膜纖維化的形成密切相關。Wang 等［24］在阻塞性腎、殘余腎、糖尿病腎小鼠模型中，發現smad7 過表達阻斷smad2、3 活化，防止tgf-β1 誘導膠原蛋白沉積，使腎纖維化變弱;tgf-β1 信號通過smad2、3 來調停腎纖維化，而激活smad7 抑制腎臟纖維化和炎癥。陳剛毅等［34］發現化痰祛瘀中藥防治腹膜纖維化的作用與其能上調tgf-β 抑制性信號蛋白Smad7 的表達、抑制tgf-β 受體調控信號蛋白Smad2/3 表達有關。

3.3 Cthrc1、tgf-β1/Smad 相互作用 Cthrc1 被確定為受特定表達于受損的動脈內外膜的tgf-β 家族的調控的新基因。同時作為一種tgf-β1 細胞特異性的抑制子，它可以反過來通過逆轉tgf-β1 的某些作用影響膠原蛋白Ⅰ和Ⅲ的沉積，新生血管的形成以及平滑肌細胞的分化。有研究表明，Cthrc1 基因的表達水平與tgf-β、骨成型蛋白-4(BMP-4)有關。序列分析發現在Cthrc1 的啟動子區域有一個SMAD位點，該位點與tgf-β 和BMP4 的調控有關［35］。綜上所述，Cthrc1 通過減少Smad 活化以抑制tgf-β1 信號通路，減少膠原沉積，共同參與皮膚纖維化。Li等［36］通過觀察cthrc1 和tgf-β1 在正常皮膚和瘢痕疙瘩中的表達，對瘢痕疙瘩中Ⅰ型膠原蛋白的表達和膠原蛋白沉積的檢測，及對重組Cthrc1 和tgf-β1的相關性的分析，得出Cthrc1 和tgf-β1 在瘢痕疙瘩中的表達比正常皮膚高;tgf-β1 誘導Cthrc1 的表達增加，兩者呈濃度依賴;在瘢痕成纖維細胞中，tgf-β1刺激Ⅰ型膠原蛋白的表達和合成;重組Cthrc1 可以抑制上述效應，表明Cthrc1、tgf-β1/Smad 共同參與組織異常纖維化。

4 小結

Cthrc1 基因是動脈損傷過程中篩選出的一種過度表達基因，其產物Cthrc1 具有促進細胞遷移、減少膠原蛋白沉積的作用，因此具有重要的臨床應用價值，是目前抗纖維化領域研究的熱點;tgf-β1 能促進成纖維細胞增殖、增加膠原等細胞外基質的合成，在增生性瘢痕、瘢痕疙瘩等纖維化疾病病變部位tgf-β1 表達增強，Smad 蛋白作為tgf-β1 信號轉導通路的始動因子參與纖維細胞增殖等生理病理過程;國內外研究顯示Cthrc1 與tgf-β1 及Smad 之間存在相互作用，并影響成纖維細胞膠原的合成，在組織纖維化機制中發揮重要作用。目前國內外對Cthrc1與tgf-β1/Smad 信號傳導通路在內臟纖維化中的研究較多，其發揮的生物學途徑及作用已較為明確;但Cthrc1 與tgf-β1/Smad 信號傳導通路在皮膚異常纖維化中的研究較少，其生物學效應機制尚不十分明確，今后可以在皮膚纖維化方面多做研究，更進一步的探討，明確其在皮膚纖維化疾病中的相互作用機制，以利于皮膚異常纖維化尋找新的治療方法。

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