干燥綜合征患者抗血小板生成素受體抗體與血小板減少的相關性研究

吳 侗，周 彬，龍 麗，張 晶，孫曉麟，李英妮

(1.四川省醫學科學院·四川省人民醫院風濕免疫科，四川 成都610072;2.北京大學人民醫院風濕病研究所，北京100044)

干燥綜合征(primary Sj gren＇s syndrome，PSS)是一種以外分泌腺淋巴細胞高度浸潤的自身免疫性疾病，人們常常注意的是PSS 的口眼干燥、腎臟受損等癥狀。隨著對該病的認識加深，發現該病對非外分泌腺組織也可侵犯，其中血液系統損害較為常見，發病率34% ～44%，目前主要針對器官損害的研究不多，對血液系統損害的研究更少。血小板減少是PSS 血液系統損害常見表現，可以單獨出現也可以合并貧血和白細胞減少出現，北京大學人民醫院任立敏醫生調查發生率在13% ～20%［1］，并且PSS 產生大量異常的自身抗體是其主要發病機制，自身免疫因素也是導致PSS 血小板減少的主要原因。血小板生成素(thrombopoietin，TPO)及其受體(c-mpl)是促進巨核細胞成熟分化釋放血小板的主要細胞因子［2～9］。本研究旨在探討抗c-mpl 抗體與PSS 患者血小板減少之間的關系。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取北京大學人民醫院風濕免疫科2012 年1 月至2013 年1 月住院的PSS 患者共計80 例，均符合2002 年干燥綜合征國際分類(診斷)標準。其中血小板減少患者40 例(血小板＜100×109/L，A 組)，無血小板減少40 例(B 組)。選擇同期住院的抗磷脂綜合征(antiphospholipid syndrome，APS)患者40 例(C 組)，均符合2004 年修訂的APS分類診斷標準;無血小板減少的系統性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus，SLE)患者24 例(D組)，均符合1997 年美國風濕病學會指定的SLE 診斷標準;正常體檢的健康志愿者40 例(E 組)，血小板計數正常并且無風濕免疫病和血液病病史。A 組男4 例，女36 例，年齡(55.64±14.98)歲(22 ～78歲);B 組男3 例，女37 例，年齡(55.56±11.13)歲(23～77 歲);C 組男3 例，女37 例，年齡(58.28±16.11)(19 ～74 歲);D 組男2 例，女22 例，年齡(49.12±14.24)歲(18 ～76 歲);E 組男4 例，女36 例，年齡(50.47±12.76)歲(19 ～69 歲)。5 組年齡、性別構成差異無統計學意義(P＞0.05)，具有可比性。

1.2 檢測方法 ①血清抗c-mpl 抗體和血清TPO水平的檢測:采集所有受試者清晨空腹靜脈血3 ml，分離血清，-80 ℃保存。酶聯免疫吸附法(enzymelinked immuno sorbent assay，ELISA)檢測血清TPO水平(試劑盒美國R＆D system 公司)，具體步驟按照試劑盒說明書進行。間接ELISA 法測定抗c-mpl抗體水平，具體步驟為:用重組人c-mpl(美國R＆D system 公司)，以1 mg/L 濃度包被96 孔板(美國costar 公司)，4 ℃過夜，PBST(2%tween 歐蒙公司)洗滌后用0.05 g/L 小牛血清蛋白(bovine serum album，BSA，SIGMA 公司)封閉非特異位點，37 ℃孵育1 h，洗滌后每孔加樣本血清(1 ︰200)100 μl，37 ℃孵育30 分鐘，洗滌后加辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)標記的羊抗人IgG(北京中杉金橋公司)100 μl/孔，37 ℃孵育30 分鐘，洗滌后加TMB(欣博盛公司)顯色劑100 ℃/孔，室溫避光反應10分鐘，2 mol/L 稀硫酸100μl/孔終止反應。BIORAD 公司iMARK 酶標儀最后測定450/570 nmOD光密度值，以OD 值大于健康對照組平均值2.1 倍為陽性。②所有PSS 患者均測定血常規、肝腎功、血沉(ESR)、免疫球蛋白(IgG/A/M)、補體C3/C4、ANA、ENA 譜、抗磷脂抗體ACL、β2-GP1 抗體、α-胞襯蛋白抗體，并且進行骨髓涂片，了解骨髓增生分級(I ～V 級)及有無巨核細胞成熟障礙。

1.3 統計學方法 運用SPSS 17.0 軟件進行統計分析。計量資料正態分布者用均數±標準差表示，采用t檢驗或方差分析;非正態分布者采用非參數檢驗(Mann-Whitney U 檢驗、Kruskal-Wallis 檢驗或Wilcoxon 檢驗)。計數資料采用χ2檢驗。P＜0.05 為差異有統計學意義。相關性分析使用person 檢驗。

2 結果

2.1 血清抗c-mpl 抗體 血清抗c-mpl 抗體在A、B、C、D 和E 組中的檢出率為62.5% (25/40)、27.5%(11/40)、12.5% (5/40)、12.5% (3/24)和0。組間比較差異有統計學意義(χ2=30.571，P＜0.001)。單獨比較A 組與B 組血清抗c-mpl 抗體差異也有統計學意義(χ2=10.666，P=0.001)。5 組抗c-mpl 抗體的OD450 值比較見表1。其中A 組與B、C、D、E 組間差異均有統計學意義(見表1、圖1)。其余各組間比較差異均無統計學意義(P＞0.05)。

表1 5 組抗c-mpl 抗體的OD450 值比較

2.2 血清TPO 水平 血清TPOA 組(199.74±29.99)pg/ml，B 組(124.19±12.25)pg/ml，E 組(14.04±1.71)pg/ml，A、B 組與E 組間差異均有統計學意義(t值分別為6.66 和10.136，均P＜0.001)，A、B 兩組間差異也有統計學意義(Z= -2.884，P=0.004)，見圖2。抗c-mpl 抗體陽性與陰性患者血清TPO 水平差異無統計學意義［(180.14±23.07)pg/ml VS.(147.32±23.71)pg/ml，P＞0.05。但分析其中3 例TPO 水平明顯升高超過400 pg/ml患者臨床資料，發現骨髓巨核細胞明顯減少，而循環血小板計數并非顯著下降。

2.3 血清抗c-mpl 抗體與血小板計數及其他臨床情況的關系 分析80 例PSS 患者抗c-mpl 抗體OD450 指數與血小板計數，發現兩者間存在線性負相關性(r=-0.32，P= 0.004)，見圖3。PSS 患者抗c-mpl 抗體OD450 指數與抗SSA 抗體具有相關性(P＜0.05)，與ESR、IgG、IgA 數值水平呈線性正相關(r分別為0.299、0.507、0.413，P＜0.05)，見圖4～6。抗c-mpl 抗體與病程、性別、IgM、C3/C4、RF、CRP、α-胞襯蛋白抗體、ACL、β2-GP1 抗體、ANA 類型和SSB 等ENA 譜無相關性。

圖1 PSS 血小板減少組與PSS 血小板正常組、APS、SLE 血小板正常組、正常對照組間抗c-mpl 抗體OD450 的比較

圖2 PSS 血小板減少組與PSS 血小板正常組、正常對照組之間TPO 水平的比較

圖3 抗c-mpl 抗體OD450 與血小板計數呈線性負相關

2.4 血清抗c-mpl 抗體與骨髓增生分化的相關性相關性分析顯示，PSS 患者抗c-mpl 抗體與骨髓增生低下(IV ～V 級)無相關性(χ2= 0.152，P=0.762)，而與巨核細胞成熟障礙(χ2=7.214，P=0.011)，及骨髓血小板生成減少具有相關性(χ2=8.209，P= 0.006)。

3 討論

TPO 主要作用是促進巨核細胞增殖和成熟分化，促進血小板生成。TPO 及其受體c-mpl 信號通路位于造血干/祖細胞(HSC/PC)和巨核細胞膜表面，TPO 通過與c-mpl 受體結合，產生信號傳遞，促進細胞分裂增殖和分化成熟［2～9］。血清中TPO 濃度主要受循環中血小板計數和骨髓中巨核細胞分化程度調控，對血小板減少性疾病有鑒別意義。抗cmpl 抗體在2002 年由Kuwama 等［10］首次提出，研究者發現部分SLE 血小板減少患者骨髓巨核細胞數目減少［11～13］，猜測可能存在抗c-mpl 抗體，此后應用ELISA 法檢測發現了抗c-mpl 抗體。抗c-mpl 抗體可與TPO 競爭結合細胞膜上的c-mpl，阻斷TPO/c-mpl 信號通路。既往認為SLE 相關血小板減少與循環中血小板破壞過多有關，但SLE 巨核細胞增殖分化障礙導致血小板減少時有報道［14～15］。目前研究［10］已證實抗c-mpl 抗體存在于SLE 血小板減少和骨髓巨核細胞成熟障礙患者循環血清中，研究發現，從SLE 抗c-mpl 陽性患者血清中純化的IgG 片段可以結合在細胞表面c-mpl 上，阻斷TPO 介導的巨核細胞單克隆形成，因此SLE 患者的巨核細胞成熟障礙血小板減少被認為是由于抗c-mpl 功能性阻斷了TPO 與c-mpl 結合活動所致?？筩-mpl 抗體并不是SLE 特異性抗體，研究發現在系統性硬化(SSc)合并血小板減少和特發性血小板減少(ITP)中也檢測出該抗體。Katsumata 等［16］報道了1 例系統性硬化血小板減少患者，其檢測抗磷脂抗體、抗血小板抗體、抗TPO 抗體均為陰性，而抗c-mpl 抗體陽性，骨髓巨核細胞成熟障礙，進一步提示抗c-mpl 抗體與骨髓巨核細胞數減少血小板減少之間的關系。

本研究選擇了PSS 血小板正?；颊吲cSLE 血小板正?；颊哌M行檢測，發現兩組抗c-mpl 抗體與正常對照者無統計學意義，提示抗c-mpl 抗體不是PSS、SLE 等自身免疫疾病特異抗體。PSS 伴有血小板減少患者檢測發現抗c-mpl 抗體明顯高于正常對照和其他自身免疫疾病患者，OD450 檢測值與血小板計數呈負性線性相關，提示抗c-mpl 抗體水平與干燥綜合征血小板減少呈正相關。本研究發現抗磷脂綜合征患者抗c-mpl 抗體水平與正常對照無統計學差異，而PSS 血小板減少患者抗c-mpl 抗體與抗磷脂抗體(ACL)無相關性，提示抗磷脂綜合征相關血小板減少與抗c-mpl 抗體相關性較小，而PSS 的血小板減少與血栓形成無相關性。本研究發現抗cmpl 抗體0D450 檢測值與ESR、血清高球蛋白(IgG/IgA)呈線性正相關，提示抗c-mpl 抗體與病情活動相關。病情活動越明顯該抗體滴度越高，提示該抗體可用于PSS 血小板減少患者病情預測和治療效果評價。本研究發現抗c-mpl 抗體與PSS 患者骨髓巨核細胞成熟障礙具有一定相關性，因此PSS 血小板減少的致病機制很可能像SLE 一樣，是由于抗cmpl 抗體導致的巨核細胞成熟障礙所致。激素治療原發性干燥綜合征血小板減少常常療效不如ITP 患者明顯，多數患者需要數月甚至更長時間才能血小板計數回升，具體的機制目前尚不明確，但可能與造血干細胞需要較長時間分化、巨核細胞成熟和增殖功能恢復有關。目前研究［17］顯示經過激素和免疫抑制劑治療后SLE 患者血小板計數恢復，并且抗cmpl 抗體轉陰，提示不僅血小板減少與抗c-mpl 抗體導致的巨核細胞成熟障礙相關，而且抗c-mpl 抗體可用于判斷治療療效。本研究中PSS 血小板減少組和血小板計數正常組TPO 水平明顯高于正常對照組，并且血小板減少組TPO 水平高于血小板正常PSS 患者組，提示TPO 水平與血小板數目呈一定相關性，血小板計數越低TPO 水平越高。抗c-mpl 陽性組與抗體陰性組相比TPO 水平無差異，提示抗cmpl 抗體不影響TPO 代謝，而是通過競爭TPO 受體c-mpl 與之結合阻斷TPO 促進巨核細胞分化成熟發揮作用。3 例TPO 水平超過正常對照30 倍患者的骨髓巨核細胞成熟障礙較循環血小板計數下降更明顯，提示巨核細胞發育程度對TPO 調節作用更明顯。本研究中血小板減少與抗c-mpl 抗體陽性并不是一一對應，說明PSS 血小板減少可能與一個包括自身免疫反應、血小板分布異常、感染和藥物等多種原因的復雜網絡相關，抗c-mpl 抗體在網絡中具有一定特殊意義，通過巨核細胞成熟障礙參與血小板生成過程，但血小板減少還與其他復雜因素有關。

本研究對PSS 相關血小板減少患者抗c-mpl 抗體作用做出初步的探討，但其在體內的作用通路機制還需要進一步研究;抗c-mpl 抗體能否用于臨床病情預測、治療評估還需要大樣本數據的分析;促TPO 受體激動劑及針對抗c-mpl 抗體的單克隆生物制劑是否是血小板減少患者治療的新靶點新方向還需要進一步研究證實。

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