蝸牛多肽混合物對過氧化氫誘導的SH-SY5Y 細胞PCNA 表達的影響

席守民，安君嶺，趙煥東，溫新麗，高永忠

1河南科技大學醫學院藥理學與醫學分子生物學重點實驗室，洛陽 471003;2 永城市中心醫院，永城 476600

氧自由基對腦神經細胞的氧化修飾作用是導致神經元損傷的主要途徑之一，在帕金森病和阿爾茨海默病的發生發展過程中具有重要的地位［1］。H2O2是一種比較常用的細胞氧化誘導劑，廣泛用于誘導細胞氧化應激模型。有研究認為阿爾茨海默病與神經細胞凋亡有關，而細胞凋亡與氧自由基密切相關［2］。增殖細胞核抗原(Proliferating cell nuclear antigen，PCNA)在細胞增殖過程中起重要作用，是評價細胞增殖狀態的重要指標［3］。蝸牛提取物中的某些成分具有增強細胞活力、促進組織細胞修復和再生的作用［4］。為了探討蝸牛多肽混合物(snail polypeptide mixture，SPM)對神經元細胞的保護作用，本文用H2O2造成人神經母細胞瘤細胞株(SHSY5Y)細胞氧化損傷模型，觀察SPM 對SH-SY5Y細胞的抗凋亡效果，為SPM 神經保護作用的深入研究打下基礎。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑

人神經母細胞瘤細胞株(SH-SY5Y)購自中國科學院上海細胞生物學研究所;白玉蝸牛，洛陽綠爾農業科技有限公司惠贈;小牛血清、DMEM 購自美國Gibco BRL 公司;Hoechst 染色試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司;兔抗人單抗PCNA:武漢博士德生物工程有限公司生產;SP 免疫組化試劑盒購自北京博奧森生物技術有限公司;DAB 顯色試劑盒購自北京鼎國昌盛生物技術有限公司。

1.2 蝸牛多肽混合物的制備

參照文獻［5］中的方法，取新鮮白玉蝸牛200 g，剁成小塊;將蝸牛組織加到500 mL 預冷的pH 3.5的冰醋酸溶液，膠體磨反復勻漿;勻漿液4 ℃，5500 rpm 離心10 min，取上清;55 ℃真空旋轉蒸發濃縮至體積為100 mL;濃縮液凍干，交聯葡聚糖凝膠G-25分離層析，得到4個峰，分別收集，MTT 法體外活性實驗檢測第2 峰值活性最強。收集第2 峰樣品，濃縮凍干，BCA 法測定樣品中蛋白質含量為84.81%，氧化酶法測定樣品中葡萄糖含量僅為0.24%，即為蝸牛多肽混合物，-20 ℃保存備用。

1.3 細胞培養及藥物處理

SH-SY5Y 用含2 mmol/L 谷氨酰胺和10%小牛血清的DMEM 培養基，在37 ℃5% CO2培養箱中培養。隔天傳代細胞，當傳代細胞在倒置顯微鏡下觀察均勻貼壁生長時，可用于實驗研究。

1.4 MTT 法檢測H2O2對SH-SY5Y 細胞的損傷作用

將生長狀態良好的SH-SY5Y 細胞以1 ×104細胞/孔接種于96 孔板，待細胞貼壁。細胞貼壁后棄去培養液，每孔加含不同濃度(0.25～6.0)mmol/L H2O2的培養液200 μL，陰性對照組加不含H2O2的培養液200 μL，繼續培養24 h 后每孔加入5 g/L MTT 溶液20 μL，繼續培養4 h 后棄去培養液，每孔加入200 μL 二甲基亞砜(DMSO)，震蕩5 min 后酶標儀490 nm 處檢測每孔的吸光度(A)值。細胞存活率=給藥組A 值/陰性對照組A 值×100%。Orgin 軟件計算半數抑制濃度IC50。

1.5 MTT 法測定SPM 對H2O2誘導SH-SY5Y 細胞損傷的抑制作用

取對數生長期的SH-SY5Y 細胞，以1 ×104細胞/孔接種于96 孔板，待細胞貼壁。細胞貼壁后模型組以1.54 mmol/L H2O2作用于SH-SY5Y 細胞。治療組分別以不同濃度(39～1250)mg/L SPM 和1.54 mmol/L H2O2作用于SH-SY5Y 細胞。對照組只加SH-SY5Y 細胞，不加藥物。細胞給藥24 h 后每孔加20 μL 濃度為5 g/L 的MTT 溶液。繼續培養4 h 后棄去培養液，每孔加入200 μL DMSO，震蕩5 min 后酶標儀490 nm 處檢測A 值。

1.6 Hoechst 染色檢測細胞凋亡

Hoechst 33342 可與凋亡細胞凝集的染色質結合，使其發出強藍色熒光，從而與正常細胞加以區別［6］。將SH-SY5Y 細胞接種于24 孔板，培養24 h后，分4 組，H2O2組:加1.54 mmol/L H2O2;對照組:正常細胞培養，不加藥物;SPM-L 組:加蝸牛多肽混合物39 mg/L 和1.54 mmol/L H2O2;SPM-H 組:加蝸牛多肽混合物156 mg/L 和1.54 mmol/L H2O2。再培養24 h 后，用PBS 洗3 次，加入新鮮配制的4%多聚甲醛固定細胞10 min，PBS 洗后用濃度為10 mg/L 的Hoechst 33342 染液作用于細胞，避光孵育15 min，PBS 小心沖洗后熒光顯微鏡下觀察攝片。每孔隨機數200個細胞，計算凋亡細胞百分比。

1.7 細胞免疫化學技術檢測細胞PCNA 的表達

取對數生長期SH-SY5Y 細胞消化制備細胞懸液，調整細胞濃度為l×104個/mL，接種于內置無菌玻片的6 孔板內。培養24 h 后，分4 組(同1.6 分組)，以上各組平行3 孔，繼續培養48 h 后，爬片用PBS 漂洗2 遍，經4%多聚甲醛固定30 min，PBS 洗滌后自然風干。檢測方法按免疫組化試劑盒說明書進行。

1.8 Western blot 檢測細胞PCNA 的表達

取對數生長期SH-SY5Y 細胞，接種于內置無菌玻片的6 孔板內。培養24 h 后，分4 組，加入不同藥物處理(同1.6 分組)。以上各組平行3 孔，繼續培養48 h 后，每孔分別加入120 μL 蛋白裂解液裂解后，在冰浴下靜置裂解30 min，95 ℃加熱5 min后，取25 μL 品進行10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，電泳結束后取出凝膠，于4 ℃下60 mA 電流轉印過夜至硝酸纖維素膜，脫脂奶粉封閉1 h 后，分別加入1∶1000 稀釋的PCNA 單抗4 ℃過夜，洗膜后用1∶2000 稀釋的二抗-辣根過氧化酶(HRP)交聯物孵育2 h，按照Super Signal west pico chemiluminescent substrate 試劑盒(PIERCE 公司，美國)說明，加入顯色劑后，X 光片于室溫下自顯影20 s，使用凝膠分析系統攝像并分析。

1.9 統計學處理

2 實驗

2.1 H2O2對SH-SY5Y 細胞存活率的影響

MTT 法檢測分析顯示，(0.25～6.0)mmol/L 不同濃度的H2O2處理SH-SY5Y 細胞24 h 后，該細胞的存活率呈濃度依賴性降低。通過Orgin 軟件計算可知，H2O2對SH-SY5Y 細胞IC50為1.54 mmol/L，見圖1。

圖1 MTT 法檢測不同濃度的H2O2處理后的SH-SY5Y細胞存活率Fig.1 Viability of SH-SY5Y cells in different concentrations of H2O2

2.2 MTT 法測定SPM 抗H2O2誘導SH-SY5Y 細胞毒性

圖2 顯示采用MTT 法檢測H2O2及SPM 處理后的SH-SY5Y 細胞存活率結果。A 組(H2O2組)顯示，加入1.54 mmol/L H2O2作用24 h 后，SH-SY5Y細胞存活率僅為(47.65 ±3.52)%，而同時加入不同濃度的蝸牛多肽的治療組的細胞生長力明顯較A組好。B 和C 組與A 組比較差異有顯著性意義(tB=-7.41，PB=0.018，tC=-7.85，PC=0.016)，D～G組分別與A 組比較差異有顯著性意義(tD=-21.30，PD=0.002，tE=-186.20，PE=0.000，tF=-54.54，PF=0.000，tG=-42.65，PG=0.001)，但B 組與C組比較以及D～G 組之間比較均無明顯差異性。提示低劑量39 mg/L(SPM-L)和高劑量156 mg/L(SPM-H)蝸牛多肽均可顯著降低H2O2引起SHSY5Y 細胞毒性。

圖2 MTT 法檢測H2O2及SPM 處理后的SH-SY5Y 細胞存活率Fig.2 Viability of SH-SY5Y cells in seven groups

2.3 Hoechst 染色檢測細胞凋亡結果

Hoechst33342 染色結果顯示，正常對照組細胞核呈彌漫均勻的低強度熒光，凋亡率僅為3.5%;1.54 mmol/L H2O2處理SH-SY5Y 細胞24 h 后，SHSY5Y 細胞呈現明顯的凋亡特征，如細胞質濃縮、細胞核碎裂等，凋亡率高達(58.39 ±8.67)%;SPM-L(1.54 mmol/L H2O2+39 mg/L SPM)組和SPM-H(1.54 mmol/L H2O2+156 mg/L SPM)凋亡率分別為(44.06 ± 4.35)% 和(32.45 ± 9.44)%，提示SPM-H 能使H2O2引起的具有凋亡特征的細胞數目明顯減少，與H2O2組比較差異有顯著性意義(t=4.312，P=0.013)，見圖3。

圖3 Hoechst 染色觀察3 組間SH-SY5Y 細胞凋亡的結果(×200)Fig.3 The results of SH-SY5Y cell apoptosis of three groups by Hoechst staining (×200)

2.4 SH-SY5Y 細胞PCNA 的表達結果

PCNA 表達于細胞核中，染色陽性信號呈棕黃色。與正常對照組相比，H2O2組SH-SY5Y 細胞PCNA 的表達明顯減少;SPM-L 組和SPM-H 組PCNA表達顯色則較H2O2組明顯增強，呈強陽性染色，且陽性細胞數明顯增加。見圖4。

2.5 Western blot 檢測SH-SY5Y 細胞PCNA 的表達結果

由圖5 可見，H2O2組SH-SY5Y 細胞PCNA 的表達明顯較正常對照組減少;而SPM-L 組和SPM-H 組細胞中PCNA 表達均較H2O2組明顯升高，即呈劑量依賴性，與H2O2組比較差異有顯著性意義(P＜0.05)。

3 討論

圖4 免疫組化檢測PCNA 在4 組SH-SY5Y 細胞中的表達(×200)Fig.4 The expression of PCNA in the SH-SY5Y cell of four groups by immunochemistry (×200)

圖5 4 組SH-SY5Y 細胞中PCNA 蛋白質的表達結果Fig.5 Expression of PCNA in SH-SY5Y cells of four groups

腦神經元損傷的機制包括自由基損傷、細胞內鈣離子超載和炎癥反應等。腦神經元損傷是由自由基損傷環節觸發，鈣離子超載為中間環節，炎癥反應為最終通路的級聯反應。氧化應激誘發的自由基損傷是導致神經元凋亡的基本原因之一，因此抗氧化是保護神經元的有效途徑。H2O2是氧化應激反應密切相關的活性氧之一，其主要產物具有很強的氧化性并可自由進入細胞，在許多神經元細胞培養模型中可引起細胞損傷，且許多中樞神經系統疾病都涉及到氧化應激損傷［7］。研究證明，用1.54 mmol/L H2O2處理SH-SY5Y 細胞，可以引起細胞存活率降低，細胞凋亡等改變。

增殖細胞核抗原PCNA 是DNA 聚合酶δ 的輔助蛋白，參與調節DNA 的合成，與細胞的增殖周期密切相關。PCNA 是伴隨細胞增殖而表達的一種核內蛋白，可作為一項評估細胞增殖狀態的指標。Savio 等［8］對靜止的纖維母細胞應用甲磺酸甲酯和H2O2處理后，發現與細胞核結合的PCNA 呈劑量依賴性增加，說明在靜止期細胞PCNA 同樣參與了受損DNA 的堿基修復過程［9］;通過將1 周齡的小鼠海馬腦片進行培養，并接受紫外線照射損傷后，發現能誘導CA3 區錐體細胞PCNA 表達增高，說明在神經系統中非增生細胞PCNA 的表達與DNA 的損傷修復有關;研究發現，用1.54 mmol/L H2O2處理SHSY5Y 細胞，細胞凋亡調控因子PCNA 的表達較正常對照組明顯減少，而SPM 處理后的SH-SY5Y 細胞PCNA 明顯增加，我們認為SPM 可能是通過改善DNA 的修復和細胞凋亡，增加細胞核PCNA 表達，從而抑制SH-SY5Y 細胞氧化損傷，起到抗氧化作用。

《本草綱目》中記載，蝸牛具有調節機體功能、促進人體新陳代謝、增強細胞活力及提高機體免疫力，對糖尿病、高血壓、高血脂、惡瘡和癌癥等疾病有輔助治療作用。研究發現，蝸牛提取物通過干擾病毒吸附和穿入宿主細胞等機制明顯抑制HBV 復制的作用，且無細胞毒性［10］。Tsoutsos D 等［4］采用蝸牛提取物用于治療開放性創傷和面部深度燙傷，發現蝸牛提取物可以促進開放性創傷和深度燙傷的皮膚愈合，提示蝸牛提取物中某些成分可促進組織細胞修復和再生。研究發現，無論是低劑量還是高劑量的SPM 均具有抗氧化作用，在(39～156)mg/L 范圍內呈濃度依賴性的抑制H2O2引起的細胞毒性作用，并且可明顯提高細胞的存活率，顯著降低H2O2誘導的細胞凋亡，提示SPM 具有神經細胞保護作用，能對抗H2O2引起的細胞凋亡。

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2 Takasaki Y，Kaneda K，Takeuchi K，et al.Analysis of the structure of proteasome-proliferating cell nuclear antigen(PCNA)multiprotein complex and its autoimmune response in lupus patients.Annals New York Acade Sci，2003，987:316-318.

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