HPLC 法測定明黨參組織培養物和栽培品中香豆素成分的含量

步 達，姚 曉，鄭紫婷，李 祥，陳建偉

南京中醫藥大學，南京 210023

明黨參Changium smyrnioides Wolff 為傘形科(Umbellifarae)多年生草本植物，去皮的根供藥用。始載于明、清時期，為現版《中國藥典》的名貴中藥之一。分布于江蘇、安徽、浙江、江西、湖北等省，江蘇為地道藥材產區。外形和療效似人參，具潤肺化痰、養陰和胃、平肝解毒之功效，為我國重點保護的珍稀瀕危植物［1］。7-羥基香豆素、花椒毒酚、歐前胡素和珊瑚菜內酯均是從明黨參中分離得到的香豆素類化合物，藥理研究表明，這四種香豆素類化合物具有明顯的抗腫瘤作用和抗氧化作用［2］。目前國內外對明黨參根、莖葉、果實的研究已有文獻報道［3-6］，但對明黨參組培產物中香豆素成分的含量測定尚未見報道，本研究建立了同時測定四種香豆素成分含量的測定方法，并比較了其在組培和栽培品不同部位的含量，為其資源的合理開發與利用提供科學依據。

1 材料、儀器與試劑

1.1 材料

實驗材料于2012 年9 月采自南京市仙林羊山，經南京中醫藥大學中藥資源學教研室陳建偉教授鑒定為明黨參Changium smyrnioides Wolff。鮮根帶土移栽到南京中醫藥大學藥苑中，在自然情況下培養。根據之前9 種激素條件下對明黨參葉片愈傷情況的優選，采用培養基組成為MS+2，4-D 0.5mg/L +KT 0.2 mg/L+NAA 1.5 mg/L+6-BA 0.5 mg/L;MS+2，4-D 1.0 mg/L+KT 0.1 mg/L+NAA 1.5 mg/L+6-BA1.5 mg/L 進行明黨參葉片的愈傷組織誘導和根誘導，并將愈傷組織和根誘導產物取出干燥備用。

1.2 儀器

Agilent 1100 液相色譜儀，自動進樣器，HT-230A 柱溫箱(HENGAoT ＆ D)，配Agilent-C18 柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm)，Agilent 公司;KQ-500DE型醫用數控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);HH-S 恒溫水浴鍋(江蘇國勝實驗儀器廠);FA-1004 電子分析天平(上海天平儀器廠);LIBRORAEL-40SM 電子分析天平(SHIMADZU);島津UV-2401 紫外掃描儀。

1.3 試劑

對照品7-羥基香豆素(批號:20120327)、花椒毒酚(批號:20110819)和歐前胡素(批號:20110520)由上海源葉生物科技有限公司提供，所有對照品經HPLC 峰面積歸一化法檢測質量分數均在98%以上;珊瑚菜內酯為本實驗室從明黨參果實中分離所得到，經UV、IR、MS、1H NMR、13C NMR 鑒定確定為珊瑚菜內酯，熔點103～104 ℃，面積歸一化法測得對照品純度為99.7%。乙腈(色譜純，美國天地有限公司);水為雙蒸水，其他試劑均為分析純(南京化學試劑有限公司)。

2 方法與結果

2.1 對照品溶液的制備

分別精密稱取對照品7-羥基香豆素、花椒毒酚、歐前胡素和珊瑚菜內酯13.03、13.02、12.08、15.53 mg，分別加甲醇超聲(300 W，40 kHz)溶解并定容，即得濃度分別為260.6、260.4、241.6、310.6 μg/mL 的對照品儲備液。分別精密移取對照品儲備液5、20、5、5 mL，用甲醇稀釋至7-羥基香豆素、花椒毒酚、歐前胡素和珊瑚菜內酯分別為50.12、13.02、57.29、68.33 μg/mL 的混合對照品溶液。

2.2 供試品溶液的制備

取干燥供試品粉末(過3 號篩)約1.0 g，精密稱定，置于50 mL 燒瓶中，加入甲醇50 mL，80 ℃加熱回流1 h，過濾，50 ℃減壓干燥，用20 mL 乙酸乙酯-蒸餾水(1∶1，V/V)萃取，共萃取3 次，合并乙酸乙酯層，50 ℃減壓干燥，用甲醇定容至10 mL，搖勻，經0.45 μm 微孔濾膜濾過，取續濾液，即得。

2.3 色譜條件及系統適用性試驗

色譜柱為Agilent-C18色譜柱(250 mm × 4.6 mm，5 μm)，流動相為乙腈(A)-水(B)梯度洗脫程序:0～5 min，5% A;5～10 min，5%～35%A;10～15 min，35%～60%A;15～40 min，60%～85%A;流速1.0 mL/min;柱溫30 ℃;檢測波長314 nm;分析時間40 min;進樣量為10 μL。在上述條件下，7-羥基香豆素、花椒毒酚、歐前胡素及珊瑚菜內酯理論板數均不低于8000。對照品和供試品的色譜圖，見圖1。

圖1 對照品及其供試品的HPLC 色譜圖Fig.1 Overlaid HPLC chromatograms of mixed standards(D)and samples (G1-G9)

2.4 線性關系

分別精密移取“2.1.1”項下7-羥基香豆素對照品儲備液1.0、3.0、5.0、7.0、9.0 mL，置于10 mL 量瓶中，用甲醇定容至刻度;花椒毒酚對照品儲備液1.0、3.0、5.0、7.0、9.0 mL，置于10 mL 量瓶中，用甲醇定容至刻度;歐前胡素對照品儲備液0.2、0.6、1.0、1.4、1.8 mL，置于10 mL 量瓶中，用甲醇定容至刻度;珊瑚菜內酯對照品儲備液0.2、0.6、1.0、1.4、1.8 mL，置于10 mL 量瓶中，用甲醇定容至刻度。按“2.2”項下的色譜條件，分別進樣10 μL，記錄峰面積。以峰面積Y(A)為縱坐標，濃度X(mg/mL)為橫坐標，進行線性回歸，得到7-羥基香豆素、花椒毒酚、歐前胡素及珊瑚菜內酯線性回歸方程及線性關系，見表1。

表1 4 種香豆素類成分的線性關系Table 1 Linear relationships of 4 investigated coumarin

2.5 精密度試驗

精密移取混合對照品溶液10 μL，按“2.2”項下色譜條件重復進樣6 次，以峰面積計算7-羥基香豆素、花椒毒酚、歐前胡素及珊瑚菜內酯RSD 分別為1.50%、2.17%、2.56%、2.50%，結果表明儀器精密度良好。

2.6 穩定性試驗

取同一供試品溶液，按“2.2”項下色譜條件測定，分別于0、2、4、6、8、12 h 進樣測定，記錄色譜圖，考察峰面積的變化，結果7-羥基香豆素、花椒毒酚、歐前胡素及珊瑚菜內酯面積的RSD 分別為1.01%、2.56%、1.91%、2.29%，表明供試品溶液在12 h 內穩定性良好。

2.7 重復性試驗

取同批次明黨參愈傷組織粉末，按“2.1.2”項下方法制備6 份供試品溶液，以“2.2”項下色譜條件進行含量測定，結果7-羥基香豆素、花椒毒酚、歐前胡素及珊瑚菜內酯的平均含量分別為0.5402、0.2836、0.0104、0.0143 mg/g，RSD 分別為1.54%、2.86%、2.75%、2.53%，表明本方法重復性良好。

2.8 加樣回收率試驗

精密稱取已知含量明黨參愈傷組織粉末約1.0 g，共9 份，精密移取7-羥基香豆素對照品(260.6 μg/mL)1.5、2.0、2.5 mL、花椒毒酚對照品(260.4 μg/mL)0.8、1.2、1.6 mL、歐前胡素對照品(241.6 μg/mL)0.02、0.03、0.04 mL、珊瑚菜內酯對照品(310.6 μg/mL)0.03、0.04、0.05 mL 的儲備液，并按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.2”項下色譜條件測定，計算回收率。結果見表2～5。

表2 7-羥基香豆素加樣回收率試驗結果Table 2 Recovery results of 7-hydroxycoumarin

表3 花椒毒酚加樣回收率試驗結果Table 3 Recovery results of xanthotoxol

表4 歐前胡素加樣回收率試驗結果Table 4 Recovery results of imperatorin

表5 珊瑚菜內酯加樣回收率試驗結果Table 5 Recovery results of phellopterin

2.9 供試品的含量測定

取9 批供試品，按“2.2.1.2”項下方法制備供試品溶液，以“2.2”項下色譜條件測定，并計算7-羥基香豆素、花椒毒酚、歐前胡素及珊瑚菜內酯的平均含量，結果見表6。

表6 不同供試品明黨參中7-羥基香豆素、花椒毒酚、歐前胡素及珊瑚菜內酯的含量Table 6 Determination of 7-hydroxycoumarin，xanthotoxol，imperatorin and phellopterin in different samples of C.smyrnioides (mg/g，n=3)

3 討論

3.1 波長的選擇

本實驗參照文獻［8，9］建立了多香豆素類成分同時測定的方法，如圖1 和表1 所示，在314 nm 波長處7-羥基香豆素、花椒毒酚、歐前胡素、珊瑚菜內酯具有良好的分離度和線性關系，能滿足明黨參藥材及組織培養物中多種香豆素成分的同時測定。在實際實驗中還選擇了268 nm 進行了監測，但綜合考慮靈敏度、穩定性等因素，故使用314 nm 作為定量波長。

3.2 供試品溶液制備方法的選擇

經過超聲處理及加熱回流2 種方法的對比實驗，結果表明加熱回流提取香豆素類成分的含量較高，故選取加熱回流提取法。比較了乙醇、70%乙醇、50%乙醇、甲醇、70%甲醇、50%甲醇等6 種提取溶劑，結果表明，采用甲醇作為提取溶劑，提取效率最高。經20、30、40、60、90 min 回流時間比較表明，回流提取60 min 時，即可達到平衡。

3.3 流動相的選擇

本實驗比較了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-磷酸-水、乙腈-磷酸-水、甲醇-醋酸-水、乙腈-醋酸-水系統及梯度洗脫條件下對樣品中花椒毒酚、歐前胡素、珊瑚菜內酯、7-羥基香豆素分離度的影響，結果表明采用乙腈-水梯度洗脫時4 種香豆素類能得到良好的分離。

3.4 明黨參及其組織培養產物中香豆素類成分的累積規律分析

由表6 可見，7-羥基香豆素、花椒毒酚、歐前胡素在9 份供試品中均有累積，珊瑚菜內酯除愈傷組織根誘導產物中未檢出外，其余8 份均有累積，除歐前胡素外，其余三者在栽培品根皮部的含量最高，表明其成分在根中主要積累在根皮部;此外，明黨參栽培品的莖葉中4 種香豆素類成分均有累積，提示明黨參傳統工藝棄之根皮和葉具有再利用價值。除花椒毒酚外，栽培明黨參中其余3 種香豆素含量明顯高于野生品，這為野生變家種，擴大藥用資源提供了一定依據。

3.5 明黨參不同組織培養產物中香豆素形成的分析

本實驗首次對明黨參組織培養兩個階段中的產物進行了高效液相色譜含量檢測，從表6 中可以看出，明黨參愈傷組織和愈傷組織根誘導的產物中7-羥基香豆素、花椒毒酚、歐前胡素、珊瑚菜內酯均有累積，表明在明黨參愈傷組織形成階段已具有合成4 種香豆素類成分的能力，且前3 種成分在根誘導產物中的含量均高于愈傷組織，提示隨著明黨參愈傷組織再分化的進行，香豆素類成分的生物合成累積量也隨之增多;但是在根誘導產物中尚未檢測出珊瑚菜內酯，是否與缺少異戊烯轉移酶和O-甲基轉移酶有關，原因有待進一步研究。

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