茶多酚的提取及其對抗生素所致腸道菌群失衡的調整和預防作用

張 凱，關家偉，季 煜，劉艷艷，楊泰浩，姜 濤，吳大暢

大連醫科大學生物技術系，大連 116044

抗菌藥物是防治感染性疾病的主要手段，在抗菌藥物的臨床應用中，過多使用和濫用情況已很突出，抗生素相關性腹瀉(AAD)、二重感染等報道日益增多［1］。此外，抗生素濫用加劇細菌耐藥已成為全世界面臨的嚴重問題。因此，合理使用抗生素、抗生素-天然產物(主要是益生元)配伍使用及尋找抗生素的替代品用于感染性疾病的治療具有重要理論和應用價值。

茶多酚(Tea Polyphenols，TP)是茶葉中多羥基酚類化合物的總稱，含量約占茶葉干重20%～30%。大量研究表明，TP 具有極強的抗自由基和抗菌、抗病毒、抗腫瘤、防治心血管疾病等作用［2］，研究價值和應用前景良好。兒茶素類是TP 的主體組分，約占65%～80%，是其藥理作用最為顯著的部分，其中表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)含量最高［3］，且其抗自由基等活性也最為突出。茶多酚提取物容易獲得且價格低廉，如能夠與抗生素聯合使用，既達到抗感染的目的，又保證腸道菌群的平衡，將對促進健康、提高全民生活質量具有重要意義。

本實驗對茶多酚進行提取，通過HPLC 對茶多酚中有效成分EGCG 進行檢測。方法中所使用的均為無毒或毒性較小的試劑，保證后續進行動物體內實驗結果的可靠性。傳統的培養技術對腸道菌群的檢測周期長、靈敏度低、重復性差，而且腸道中大部分微生物屬于厭氧或兼性厭氧菌，對培養條件要求極為苛刻，體外培養十分困難。基于此，本實驗對文獻報道的糞便細菌DNA 提取方法進行了改良，建立了一種簡便、快捷、有效的DNA 提取方法，并采用分子微生態學PCR-DGGE(Polymerase Chain Reaction-Denaturing Gradient Gel Electrophoresis)技術評價茶多酚對改善和預防抗生素所致小鼠腸道菌群失衡的作用，以期為進一步推廣應用茶多酚提供實驗依據和理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

SPF 級，體重(20 ±2)g 雌性BALB/c 小鼠24只，由大連醫科大學實驗動物中心提供［動物合格證號:SCXK(遼)2008-0002］。

1.1.2 主要試劑

綠茶(特級，福建當年產);溶菌酶(Amresco，L0663);蛋白酶K(Merck，1245680100);表沒食子兒茶素沒食子酸酯標準品(批號:100422);頭孢拉定(修正藥業集團股份有限公司，批號:100608)溶于無菌水，制成25 mg/mL 的頭孢拉定溶液;PCR 引物由大連寶生物公司合成，Ex Taq DNA 聚合酶購自大連寶生物公司，丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺購自美國Sigma 公司;去離子甲酰胺、尿素、四甲基乙二胺(TEMED)、溴化乙錠(EB)等購自上海生物化學試劑工程公司;乙醇(色譜純)，乙腈(色譜純)。

1.1.3 主要儀器

DCode 變性梯度凝膠電泳系統(大連競邁生物科技有限公司)，PCR2400 循環儀(Thermo，USA)，凝膠成像系統(大連競邁生物科技有限公司)，微量核酸蛋白測定儀(NanoVue，USA)，FA2004 分析天平(上海越平科學儀器有限公司)，CT15RT 高速冷凍離心機(上海天美科學儀器有限公司)，電泳儀(大連競邁生物科技有限公司)，PHs-3C 精密pH 計(上海精密科學儀器有限公司)，離心濃縮儀(Thermo Scientific ISS110)，索氏提取器(上海矩源機械設備有限公司)，高效液相色譜儀(Waters 1525 HPLC)。

1.2 方法

1.2.1 茶多酚的提取

［4］方法并加以改進:準確稱取30g 茶葉末于索氏提取器中，加入300 mL 70%乙醇，70 ℃條件下回流2 h。移取濃縮后的茶多酚提取液10 mL 于小燒杯中，加入0.415 mol/L ZnCl2水溶液，搖勻，用質量分數15% NaHCO3水溶液調節為pH=6.0，離心得茶多酚—鋅鹽沉淀，用蒸餾水洗滌沉淀2 次后轉移至燒杯中，加入2 倍體積的蒸餾水混勻，再加入2 倍體積的2 mol/L 硫酸溶液，使沉淀物溶解，離心去除少量膠狀沉淀。茶多酚酸轉移液用15% NaHCO3溶液調節pH=5.0，再用乙酸乙酯在室溫下分兩次萃取，合并萃取液(20 ℃以下，轉溶15 min)。在乙酸乙酯相中加入質量分數為2%的維生素C 水溶液(用檸檬酸調節pH 為3.0)，兩者體積比為2∶1，洗滌兩次。60 ℃減壓濃縮酯相，離心濃縮后得到茶多酚粉末。

1.2.2 HPLC 檢測茶多酚

精密稱取1.2.1 制備的茶多酚粉末100 mg 溶于2 mL 去離子水中，搖勻，經0.45 μm 微孔濾膜過濾，取濾液，即得質量濃度為50 g/L 的供試品溶液。以0.2 mg/mL EGCG 為標準品，處理方法同上。色譜條件:色譜柱:Agilent ZORBAX SB-C18柱(4.6mm×250 mm，5 μm);流動相:A 為2%乙酸水溶液，B為乙腈;梯度洗脫:0～20 min，5%B;20～40 min，30%B;40～50 min，70%B;50～55 min，100%B;柱溫:30 ℃;檢測波長:280 nm;流速:0.8 mL/min;進樣量:20 μL。茶多酚主要成分的定量分析結果通過和標準品檢出時間和波峰的峰面積對比得到。

1.2.3 小鼠模型的建立與樣品采集

將24 只BALB/c 小鼠隨機均分4 組。分別為正常對照組(0.2 mL/d 的蒸餾水連續灌胃7 d)、失調模型組(頭孢拉定0.2 mL/d 連續灌胃7 d)、治療組(頭孢拉定0.2 mL/d 的劑量連續灌胃7 d 后以0.5 g/Kg/d 量的茶多酚灌胃7 d)和預防組(與治療組相反藥物使用順序灌胃)。于四組小鼠最后一天灌胃后采集潔凈無污染的糞便一次，-80 ℃保存，備用。

1.2.4 糞便樣品的預處理

稱取0.1 g 糞便于無菌Ep 管中，加入1 mL PBS(pH 7.4)，旋窩震蕩混勻，200 g 離心5 min，取上清(冰水浴)。向沉淀中加入1 mL 的PBS，重復上述步驟。混合兩次上清，用300 g 離心5 min，棄沉淀。上清用10000 rpm 離心8 min，沉淀菌體。以PBS 洗滌至上清無色。-20 ℃過夜保存。

1.2.5 糞便細菌總DNA 的提取

參照鄭剛等［5］改進溶菌酶法并加以優化，對糞便細菌總DNA 進行提取:取樣品加入0.8 mL 溶菌酶溶液(10 mg/mL)，10 μL 蛋白酶k(20 mg/mL)，混合物在37 ℃搖床下200 rpm 震蕩1 h。加入經65℃預熱的0.3 mL 裂解液(10%十二烷基磺酸鈉、0.1mL NaCl、0.5 mol/L Tris-HCl，pH 8.0)，0.3 mL磷酸鹽緩沖液(pH 8.8)，0.6 mL 氯仿-異戊醇(體積比24∶1)，65 ℃水浴10min，每隔2～3 min 上下顛倒震蕩30 s。5000 rpm 離心3 min 后小心吸取上清轉入另一2 mL 離心管中，并加入0.6 倍體積的異丙醇，冰水浴沉淀15 min。然后12000 rpm 離心10 min，棄去液相，沉淀以75%乙醇(4 ℃預冷)1 mL 輕微震蕩洗滌，4 ℃條件下13000 rpm 離心2 min，待乙醇徹底揮發后，加入100 μL TE 緩沖液溶解DNA。取1 μL 于微量核酸蛋白測定儀上測定其DNA 濃度，并通過1%瓊脂糖凝膠(含EB 0.5 g/mL)電泳檢測其質量。于-20 ℃保存備用。

1.2.6 16S rRNA 片段的PCR 擴增

利用通用引物擴增所有細菌16S rRNA 基因的V3 可變區，引物設計時需在上游引物5'端加上GC夾。通用引物以及GC 夾的序列如下［6］:

上游引物:GC-341F(5'-CGCCCGGGGCGCGCCCCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGCCTACGGG AGGCAGCAG-3')(粗體部分為40bp“GC 夾”)

下游引物:518R(5'-ATTACCGCGGCTGCTGG-3')

擴增體系(25 μL)為:10 × Ex PCR Buffer(Mg2+plus)5 μL，dNTP mixture 4 μL，1% BSA(1 mg/mL)2.5 μL，20 μmol/L 的上下游引物各0.5 μL，5 U/μL Ex Taq DNA 聚合酶0.25 μL，總DNA 2 μL 作為模板，ddH2O 10.25 μL 補充體系至25 μL。PCR 反應條件:95 ℃，5 min;30個循環(94 ℃30 s，54 ℃30 s，72 ℃30 s);72 ℃7 min。PCR 產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，-20 ℃保存。

1.2.7 DGGE 電泳分析

參照Walter J 等［7］方法，對1.2.6 獲得的16S rRNA 基因的V3 可變區的擴增產物進行DGGE 電泳。DGGE 采用8.0%聚丙烯酰胺凝膠，變性梯度為30%～50%(100%變性劑溶液包括40%去離子甲酰胺和7M 尿素)。電泳溫度為60 ℃，以100 V 電壓預電泳10 min，再將電壓調至40 V，電泳5 h。電泳完畢后，進行EB 染色，利用Phoretix 1D(Phoretix，Newcastle upon Tyne，UK)軟件分析PCR-DGGE 膠圖譜［8］。包括條帶數目、灰度值以及通過聚類分析顯示DGGE 圖譜的相似性，各條帶的聚類分析應用UPGMA 算法進行分析。利用Shannon-Weaver index(H’)計算條帶的多樣性。并采用均勻度Evenness(E)分析菌群分布的統一性，由于數據不服從正態分布，故利用非參數統計分析U 檢驗。H’和E 通過以下公式獲得:Shannon-Weaver index (H’)=-∑(Pi)(In Pi)，Evenness (E)=H’/InS，其中Pi=ni/N，ni 為單個條帶的灰度值，N 為所有條帶的灰度值，S 為樣品條帶數目。

1.2.8 DGGE 圖譜中部分優勢條帶的序列分析

切下DGGE 圖譜中清晰且亮度高的條帶，放入Ep 管中搗碎，加入50 μL 去離子水-20 ℃過夜。90℃水浴10 min，離心(10000 g，5 min)。以上清液為模板，利用無GC 的V3 區引物341F 和518R，再次進行PCR 反應，反應條件同1.2.6，1%瓊脂糖電泳確認是否出現單一條帶。PCR 產物由Invitrogen(北京公司)測序，測序結果經DNAStar 軟件分析，所得序列在GenBank 數據庫中進行Blast 比對分析。

2 實驗結果

2.1 茶多酚的提取

HPLC 檢測結果如圖1 所示，EGCG 的保留時間約為13.5 min，各峰分離度較好。由樣品色譜圖(A)可見，所提取的茶多酚原料中除EGCG(主峰)外，還有其他色譜峰，可能為表兒茶素沒食子酸(ECG)等成分，這也與前言所述理論相符，提示茶多酚的提取效果比較好，能夠進行后續實驗。以樣品EGCG 峰面積與標準品峰面積之比及公式［EGCG 含量(%)=測得的EGCG 平均含量/茶多酚質量×100%］換算出TP 中EGCG 百分含量為42.67%。

圖1 茶多酚樣品(A)及EGCG 標準品(B)的HPLC 圖譜Fig.1 HPLC chromatograms of Tea Polyphenols (A)and EGCG standard (B)

2.2 糞便細菌總DNA 的提取

使用改進溶菌酶方法提取的細菌總DNA 用1%瓊脂糖電泳后可在紫外燈下看到清晰的單一條帶，且亮度較強，偶見上樣口有少許亮帶(圖2)，分析可能是由于在提取的過程中蛋白沒有除凈，這也與表1 中OD260nm/OD280nm小于1.8，提示有蛋白污染結果吻合。該污染經證實對PCR 影響較小，可進行后續實驗。

表1 DNA 純度和濃度檢測結果Table 1 Detection of DNA purity and concentration

圖2 糞便細菌基因組提取結果Fig.2 Extraction results of total DNA of fecal microorganism

2.3 16S rRNA 目的基因的PCR 擴增

利用通用引物擴增各組小鼠腸道細菌16S rRNA V3 區基因。目的條帶片段長度約200bp(圖3)。

圖3 V3 區16S rRNA 基因擴增Fig.3 PCR amplification of V3 region of 16S rRNA gene

2.4 DGGE 圖譜分析

各實驗組小鼠腸道菌群的DGGE 圖譜顯示，各泳道的均勻性較好(表2)，通過香農指數Shannon-Weaver indexes (H’)比較腸道菌群種類的多樣性差異(表2，圖4、5)，圖譜主要分為兩簇:第一簇是泳道1、4、5;第二簇是泳道2 和3;簇間具有較高的相似度。結果提示經抗生素致失衡后小鼠腸道菌群發生顯著改變(P＜0.05)，茶多酚預防與治療后與正常對照組比較差異明顯減小，菌群多樣性基本一致。

圖4 各實驗組DGGE 圖譜Fig.4 DGGE profiling of different experiment group

表2 各實驗組微生物多樣性分析Table 2 Microbiota diversity index analysis of each group

圖5 各組小鼠腸道菌群UPGMA 相似性聚類分析Fig.5 Dendrogram of DGGE profiles analyzed by UPGMA method

2.5 測序結果分析

對DGGE 圖譜中的主要差異條帶進行測序，所得結果在GenBank 數據庫中進行Blast 比對和同源性比較，結果如表3。

3 討論

人體是一個巨大的微生態系統，尤其腸道菌群的平衡對機體健康具有重要意義，如:促進消化，抵御致病菌侵襲，營養物質的代謝吸收、維生素的攝取，增強機體免疫力等。多種因素可以導致腸道菌群失衡，如精神壓力、飲食、服用某些藥物等。臨床上，長期大量使用抗生素進行治療的患者極易造成腸道菌群的失調，因此尋找一種有效且副作用小的治療與預防藥物具有十分重要的意義。

表3 DGGE 主要差異條帶分析結果Table 3 Identification by sequence of V3 fragments excised from DGGE dominant bands of total microbial community

本實驗對茶多酚的提取以及其對抗生素所致腸道菌群失調的調整和預防作用進行了研究，結果表明，使用ZnCl2沉淀，乙酸乙酯進行萃取的方法可以有效的對茶葉中的茶多酚進行提取，且HPLC 檢測茶多酚中的有效成分EGCG 的含量可達42.67%。使用自主改進的溶菌酶方法對糞便中細菌總DNA提取效果顯著，后續實驗中，基因組中16S rRNA 片段可有效進行PCR 擴增。DGGE 圖譜分析顯示，使用抗生素作用小鼠后，電泳條帶數量和強度都有明顯變化，提示腸道菌群的豐富度與多樣性改變，證明抗生素的使用導致腸道內環境發生改變，引起菌群紊亂。茶多酚作用后，小鼠腸道菌群失調狀況有所糾正，并且由UPGMA 相似性聚類分析可知預防組在給茶多酚后再用抗生素致紊亂，發現其腸道菌群和正常組腸道菌群的相似度最高，說明茶多酚預防作用效果良好，并優于治療作用。對于茶多酚發揮作用的確切靶細菌，DNA 測序及比對分析提示主要有:費克藍姆菌、產黑色普雷沃菌、酵單胞菌、亞硝化螺菌、擬桿菌。已有研究表明，擬桿菌是腸道絕對優勢菌，這種優勢菌通過自身的定植直接抑制其他有害菌群的黏附，而且在菌群失調時重新引入擬桿菌，可以盡快使宿主腸道內微生態體系恢復平衡狀態［9］，本研究結果表明茶多酚可以發揮益生元的作用促進腸道益生菌的增殖，進而促進腸道菌群平衡的重建。

茶葉中的茶多酚廉價易得，且屬于天然產物，對機體的毒副作用小，因此具有極大的商業價值。本實驗進一步證明了茶多酚在腸道菌群失衡中的作用，為其在臨床治療上的應用提供了一定的理論基礎。相信茶多酚在工業生產以及臨床上會有更加廣闊的應用前景。

參考文獻

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