高效液相色譜法測定灰兜巴對α-葡萄糖苷酶的抑制作用

孫彥敏，彭 亮，李知敏

江西科技師范大學(xué)藥學(xué)院，南昌 330013

糖尿病是一種常見的內(nèi)分泌代謝疾病，已成為嚴(yán)重威脅人類健康的慢性病之一。不管在發(fā)達(dá)國家還是在發(fā)展中國家，由于人們的生活和飲食習(xí)慣，糖尿病已成為一種常見病。α-葡萄糖苷酶抑制劑作為一種新型糖尿病治療藥物，其重要性已經(jīng)得到越來越多的關(guān)注。α-葡萄糖苷酶抑制劑可通過阻止α-葡萄糖苷酶在小腸內(nèi)的消化而減少低聚糖和二糖消化為單糖的量，從而降低血糖吸收速率［1］。α-葡萄糖苷酶抑制劑通過調(diào)節(jié)α-葡萄糖苷酶活性可治療病毒感染、腫瘤、肥胖癥、溶酶體貯積癥［2］、高三酰甘油血脂癥［3］等多種疾病，其臨床應(yīng)用廣泛。目前，臨床上的α-葡萄糖苷酶抑制劑大多是生物合成藥或者半合成藥，其價格昂貴且副作用大，臨床研究表明部分患者在使用α-葡萄糖苷酶抑制劑類降糖藥物后，會出現(xiàn)腸胃腹瀉、痙攣等不同程度的不良反應(yīng)［4］，部分西藥的毒副反應(yīng)可能會加重其他器官組織的負(fù)擔(dān)，如心血管系統(tǒng)、腎臟系統(tǒng)等，導(dǎo)致糖尿病并發(fā)癥的嚴(yán)重，因此，從天然藥物中尋求安全有效的α-葡萄糖苷酶抑制劑的目標(biāo)越來越迫切［5］。

灰兜巴又名閉口袋，近千年來，在峨眉山地區(qū)被當(dāng)?shù)鼐用裼脕矸乐翁悄虿。?］。其有“仙山靈藥”、“糖尿病克星”和“天然純綠色的大自然珍寶”的美譽(yù)［7］。目前，α-葡萄糖苷酶抑制劑體外篩選以4-硝基酚-α-D-吡喃葡萄糖苷(PNPG)［8］作為底物，PNPG在α-葡萄糖苷酶的催化作用下可分解為PNP，以PNP 作為檢測峰可衡量中藥對于α-葡萄糖苷酶的抑制作用。α-葡萄糖苷酶抑制劑體外篩選現(xiàn)多選用紫外分光光度法作為檢測手段，但是試劑消耗大，且重現(xiàn)性差，尤其對復(fù)雜樣品或者有顏色干擾的樣品，其假陽性高［9］。而PNP 在HPLC 上有一明顯的峰［10］，故本研究采用HPLC 測定灰兜巴各提取部分對α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用，根據(jù)PNP 峰面積的變化值來計算灰兜巴抑制α-葡萄糖苷酶活性，作為衡量標(biāo)準(zhǔn)，并在反應(yīng)過程中比較振蕩和不振蕩對抑制率的影響。

1 材料與儀器

1.1 實驗材料

灰兜巴購自峨眉山灰兜巴批發(fā)零售中心

1.2 實驗試劑

α-葡萄糖苷酶、4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷(PNPG)及還原型谷胱甘肽均購自美國Sigma 公司產(chǎn)品;對硝基苯酚(PNP)購自上海源葉生物科技有限公司;pH 6.8 磷酸鉀(PBS)緩沖液、無水碳酸鈉(Na2CO3)、二甲亞砜(DMSO)、甲酸、無水乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇等試劑均為國產(chǎn)分析純，甲醇，乙腈為色譜純。

1.3 實驗設(shè)備

Agilent 1100 高效液相色譜儀，安捷倫有限公司;美國Vortex-Genie2 渦旋振蕩器，美國Scientific Industries 公司;FA2004N 電子天平，上海精密科學(xué)儀器有限公司;XS203S 電子精密天平，瑞士梅特勒-托利多;LR 4000 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，德國海道夫。

2 實驗方法

2.1 灰兜巴提取物的制備

稱取一定量的灰兜巴置于圓底燒瓶中，以1∶10(M/V)料液比向其中加入75%的乙醇，85 ℃回流提取1.5 h，反復(fù)3 次，合并濾液，收集濾渣待用。將所得的乙醇提取液濃縮至無醇味，用1∶1(V/V)石油醚萃取8 次，合并萃取液后，減壓濃縮至干，得到灰兜巴石油醚萃取部分，記為HDB-1。將石油醚萃取后的剩余溶液，用1∶1(V/V)乙酸乙酯萃取8 次，合并萃取液，減壓濃縮至干，得到灰兜巴乙酸乙酯萃取部分，記為HDB-2。將乙酸乙酯萃取后的剩余溶液，用1∶1(V/V)正丁醇萃取8 次，合并萃取液，減壓濃縮至干，得到灰兜巴正丁醇萃取部分，記為HDB-3。將正丁醇萃取剩余后的溶液減壓濃縮至干，得到灰兜巴萃取剩余部分，記為HDB-4。將醇提后的灰兜巴濾渣用蒸餾水在95 ℃下提取1.5 h，重復(fù)3 次，合并濾液并減壓濃縮至干，得灰兜巴水提取液，記為HDB-5。

2.2 HPLC 分析條件

色譜條件:Kromasil 100-5 C18(4.6 mm × 250 mm，5 μm)色譜柱;Agilent C18(4.6 mm ×12.5 mm，5 μm)保護(hù)柱;流動相:A 為乙腈，B 為含0.1%甲酸的水溶液，梯度洗脫條件為0～8 min，20%～30%A;8～13 min，30%～80% A;13～18 min，80%～20%A;18～28 min，20%A;流速:1.0 mL/min;進(jìn)樣量:20 μL;柱溫:25 ℃;檢測波長:314 nm。

2.3 PNP 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

精密稱取0.0209 g PNP 標(biāo)準(zhǔn)品，用磷酸鹽緩沖溶液超聲溶解，定容于25 mL 容量瓶中，配制成0.84 mg/mL 的PNP 母液，將母液分別稀釋成0.0025、0.005、0.01、0.05、0.1 mmol/L 濃度。

將上述不同濃度的PNP 標(biāo)準(zhǔn)品按照2.2 中色譜條件測定，以峰面積為橫坐標(biāo)，濃度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.4 HPLC 方法學(xué)考察

精密度試驗:精密吸取0.01 mmol/L PNP 溶液，連續(xù)進(jìn)樣6 次，記錄PNP 峰面積的RSD 值;穩(wěn)定性試驗:精密吸取PNP 溶液，分別于0、1、2、3、4、5、6 h不同時間進(jìn)樣20 μL，記錄峰面積，計算RSD 值，檢測PNP 的穩(wěn)定性;重現(xiàn)性試驗:在相同條件下重復(fù)做樣6 次，按2.2 項中色譜條件檢測，記錄峰面積，計算RSD 值;回收率試驗:不加反應(yīng)藥液，將α-葡萄糖苷酶替換為PNP 標(biāo)準(zhǔn)溶液做陰性對照，按60%、80%、100%、120%、140%水平分別添加對照品，進(jìn)行測定，計算回收率。

2.5 灰兜巴不同提取物抑制α-葡萄糖苷酶活性實驗流程

取2個試管，分別加入67 mmol/L pH 6.8 的磷酸鉀緩沖液1.0 mL，3 mmol/L 谷胱甘肽溶液0.2 mL，0.04 mg/mL α-葡萄糖苷酶溶液0.3 mL，及0.25、0.5、1.0、2.0、4.0 mg/mL 灰兜巴醇提石油醚萃取物、醇提乙酸乙酯萃取物、醇提正丁醇萃取物、萃取剩余物、水提物均0.3 mL，混勻，37 ℃水浴保溫10 min 后，加入0.2 mg/mL 的PNPG 溶液0.5 mL，反應(yīng)10 min 后，再加入0.1 mol/L 碳酸鈉溶液8 mL終止反應(yīng)，其反應(yīng)液過0.45 μm 微孔濾膜后，用HPLC 按2.2 項所述色譜條件進(jìn)行檢測，PNP 峰面積記為A1。

另取試管，用等體積溶解樣品的試劑作空白，實驗步驟同上，PNP 峰面積記為A2。按以下公式計算α-葡萄糖苷酶抑制率:

2.6 振蕩對藥物抑制率影響的研究

分別取0.08 mg/mL 的HDB-1，0.05 mg/mL 的HDB-2，0.3 mg/mL 的HDB-3，2 mg/mL 的HDB-4 和2 mg/mL 的HDB-5 為樣品檢測，按2.5 中反應(yīng)條件，在水浴反應(yīng)過程中分別對其每2 min 振蕩5s;不振蕩，每組實驗重復(fù)5 次。最終用碳酸鈉終止反應(yīng)，將反應(yīng)完畢的溶液0.45 μm 微孔濾膜過濾，以2.2中的色譜條件用高效液相進(jìn)行定量分析，計算其抑制率并比較振蕩和不振蕩對灰兜巴抑制α-葡萄糖苷酶活性作用影響的差異。

3 實驗結(jié)果

3.1 PNP 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線

按照2.3 的方法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得回歸方程為Y=6599.6X +1.2734，R2=0.9998，說明PNP 在0.0025～0.1 mmol/L 濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

3.2 HPLC 方法學(xué)考察

精密度試驗:PNP 峰面積的RSD 值為0.295%，表明儀器精密度良好;穩(wěn)定性試驗:分別在0、1、2、3、4、5、6 h 不同時間檢測PNP 的穩(wěn)定性，其RSD 值為0.65%，證明PNP 在此條件下穩(wěn)定性良好;重復(fù)性試驗:PNP 峰面積的RSD 值為0.79%，表明此反應(yīng)條件操作可重復(fù)性較好，有良好的重現(xiàn)性;回收率試驗:實驗測的的回收率分別為98.08%、101.13%、100.97%、99.24%、101.29%，由此證明標(biāo)準(zhǔn)曲線準(zhǔn)確性良好。

3.3 振蕩對酶抑制率的影響

分別取0.08 mg/mL 的HDB-1，0.05 mg/mL 的HDB-2，0.3 mg/mL 的HDB-3，2 mg/mL 的HDB-4 和2 mg/mL 的HDB-5，按2.5 中反應(yīng)條件，在水浴反應(yīng)過程中分別對反應(yīng)溶液每2 min 振蕩5 s;不振蕩。反應(yīng)結(jié)束后，按照2.2 的色譜條件進(jìn)行檢測，并計算酶抑制率。實驗結(jié)果見表1，HPLC 譜圖見圖1。

表1 振蕩對灰兜巴提取物抑制α-葡萄糖苷酶活性的影響(x± s，n=5)Table 1 Effect of shaking on the α-glucosidase inhibition rate (x± s，n=5)

圖1 灰兜巴各提取部分振蕩與不振蕩的HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of reaction with and without shaking

由表1 和圖1 的結(jié)果可以看出，振蕩對反應(yīng)結(jié)果的影響很大，5 種灰兜巴提取部分在振蕩后，抑制率均明顯較不振蕩要高。因此，在后續(xù)的酶抑制試驗中，反應(yīng)溶液采用每2 min 振蕩5 s，以保證反應(yīng)結(jié)果的準(zhǔn)確性和重復(fù)性。

3.4 灰兜巴各提取部分抑制α-葡萄糖苷酶的活性

按照2.2 的反應(yīng)條件和色譜條件進(jìn)行試驗，并計算酶抑制率，試驗結(jié)果見圖2，同時根據(jù)2.5 的反應(yīng)條件，但不加α-葡萄糖苷酶，以考察灰兜巴各提取部分中是否存在與PNP 結(jié)構(gòu)相似的成分，以及在酶反應(yīng)條件下，灰兜巴各提取部分是否會使PNPG分解產(chǎn)生PNP，試驗結(jié)果的HPLC 譜圖見圖3。

圖2 灰兜巴各提取物對α-葡萄糖苷酶的抑制率Fig.2 Inhibitory activity of different HDB extracts on α-glucosidase

圖3 不加α-葡萄糖苷酶的反應(yīng)結(jié)果Fig.3 The reaction result without α-glucosidase

由圖3 可看出，不加α-葡萄糖苷酶的反應(yīng)液在13.9 min 附近沒有峰出現(xiàn)，證明灰兜巴各提取部分在PNP 峰處無干擾峰出現(xiàn)，不會對試驗結(jié)果產(chǎn)生干擾。圖2 表明灰兜巴具有良好的α-葡萄糖苷酶抑制作用，且灰兜巴石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取部分的抑制活性較高，而醇提剩余部分和水提部分的抑制活性較低。

4 結(jié)果與討論

本研究首次通過高效液相色譜法研究灰兜巴石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物、醇提萃取剩余物以及水提取物對α-葡萄糖苷酶的抑制活性并比較在反應(yīng)過程中振蕩對抑制率的影響。4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷(PNPG)在α-葡萄糖苷酶的催化作用下，可生成對硝基酚(PNP)和葡萄糖，在本次研究中，我們?nèi)NP 作為檢測峰［10］，通過高效液相色譜法檢測PNP 峰面積的變化從而反映供試品對α-葡萄糖苷酶抑制能力的強(qiáng)弱。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，灰兜巴石油醚萃取部分、乙酸乙酯萃取部分和正丁醇萃取部分均有良好的抑制活性，而灰兜巴醇提剩余部分和水提部分的抑制活性較弱。同時通過比較在反應(yīng)過程中對反應(yīng)液進(jìn)行振蕩與不振蕩，發(fā)現(xiàn)振蕩以后其抑制率會增加，而且試驗結(jié)果的重現(xiàn)性更好。這可能是因為每隔一段時間振蕩后，藥物與酶在溶液中的分布更加均勻，從而使酶與藥物的反應(yīng)過程更加穩(wěn)定。因此，在后續(xù)的研究過程中應(yīng)嚴(yán)格控制振蕩頻率及時間，以保證試驗結(jié)果的重復(fù)性良好。

通過研究表明灰兜巴可通過抑制α-葡萄糖苷酶的活性從而發(fā)揮其降糖作用，為一種良好的α-葡萄糖苷酶抑制劑。項目組前期利用紫外-可見分光光度法對灰兜巴各提取部分的α-葡萄糖苷酶抑制作用進(jìn)行了初步研究［11］，在試驗過程中發(fā)現(xiàn)，由于各提取部分本身在檢測波長下均有吸收，會對試驗結(jié)果產(chǎn)生較大干擾，導(dǎo)致試驗結(jié)果重現(xiàn)性較差。因此，本次實驗選用HPLC 法測定PNP 的峰面積，再計算酶抑制率。高效液相色譜法較于傳統(tǒng)的紫外分光光度法檢測α-葡萄糖苷酶的抑制活性，誤差小，重現(xiàn)性高，可有效將所需峰與其他干擾峰分離開，通過調(diào)整保留時間可消除藥物本身對于PNP 檢測峰的影響，使結(jié)果更加準(zhǔn)確可靠，是一種更為簡單、有效且新穎的研究α-葡萄糖苷酶抑制的方法。

1 Ye F，Shen Z，Xie M.Alpha-glucosidase inhibition from a Chinese medical herb Ramulus mori in normal and diabetic rats and mice.Phytomedicine，2002，9:161-166.

2 Fan P，Lara T，Anne-Emmanuelle H，et al.Antioxidant and enzyme inhibition activities and chemical profiles of Polygonum sachalinensis F.schmidt ex Maxim(Polygonaceae).Fitoterapia，2010，81:124-131.

3 Feng CG(馮長根)，Chen L(陳凌)，Liu X(劉霞).Progress on research of α-glucosidase inhibitor from herbal medicines.Chin New Drug J(中國新藥雜志)，2005，14:669-672.

4 Zheng D(鄭丹).Study on the Huidouba Oral Liquid Preparation.Changchun:Jinlin University(吉林大學(xué))，Msc.2011.

5 Xu QY(許芹永)，Zhu JB(朱靖博)，Wang ZZ(王振中)，et al.The research of α-glucosidase inhibitors from Cortex cinnamomi.Nat Prod Res Dev(天然產(chǎn)物研究與開發(fā))，2012，24:1246-1249.

6 Zhao JH(趙勁航)，Tian SQ(田淑琴).Study on diabetes mellitus therapeutic effects of traditional Chinese medicine Compound HDB.Southwest Univ Nation(西南民族大學(xué)學(xué)報)，2008，34:1186-1188.

7 Chen YZ(陳燕忠)，F(xiàn)u MY(符美燕)，Xie QC(謝清春)，et al.Extraction and assaying of Huidouba polysaccharides.Chin J Exp Tradit Med Form(中國實驗方劑學(xué)雜志)，2011，17(6):79-82.

8 Pierre C，Roland R，Tremblay P.Nitrophenol-α-glucopyramoside as substrate for measurement of maltase activity in human semen.J Clin Chem，1978，24:208-211.

9 Hu FL，Deng CH，Zhang XM.Development of high performance liquid chromatography with immobilized enzyme onto magnetic nanospheres for screening enzyme inhibitor.J Chromatogr B，2008，871:67-71.

10 Zhu WJ(朱文佳)，Kou ZN(寇自農(nóng))，Zhang X(張曦)，et al.Study of screening method for α-glucosidase inhibitors in vitro.Food Res Dev(食品研究與開發(fā))，2012，33:171-176.

11 Li ZM(李知敏)，Peng L(彭亮).Inhibitory effect on α-glucosidase of Huidouba extracts in vitro.Lishizhen Med Mater Med Res(時珍國醫(yī)國藥)，2012，23:1379-1380.