響應曲面法優化檸檬皮渣苦素提取工藝

李建鳳，廖立敏，2*

1內江師范學院 化學化工學院;2 四川省高等學校“果類廢棄物資源化”重點實驗室，內江 641112

柑橘類水果為我國第三大國際貿易農產品，四川是我國柑橘類水果的主要產地之一，盛產檸檬、柑橘、塔羅科血橙和臍橙等柑橘類水果。內江地區是四川柑橘類水果的主要生產基地之一，四川安岳，早在二三十年代就開始種植檸檬，被譽為“中國檸檬之鄉”。內江現有檸檬種植面積13 萬畝，其附近的安岳現有檸檬種植面積23 萬畝，總產值近18 億元。內江現有飲料制造企業近50 家，內江及安岳年加工柑橘類鮮果100 余萬噸。而柑橘類果皮渣是柑橘類水果加工業的主要副產物，約占整個果重的25%～40%，因此內江及安岳每年產生約25～40 余萬噸的柑橘類果皮渣廢棄物。傳統的處理方法是將其直接進行丟棄、填埋或小部分加工成飼料，從環境和經濟的角度分析，都是不科學、不合理的解決途徑，造成了極大的浪費，給當地環境帶來了負面影響。因此柑橘果皮的綜合利用對提高柑橘加工廠的經濟效益和減少污染、保護環境都是十分有利的。

檸檬皮渣中含有豐富的果膠［1］、黃酮［2］、檸檬苦素等活性物質，對其合理利用具有較好的經濟效益和環境效益。檸檬苦素類化合物是一類三萜類物質，研究表明其具有明顯的抗菌［3］、抗癌［4］和昆蟲不育［5］等作用。目前對苦素類物質的提取分離方法主要有水抽提法［6］、有機溶劑提取法［7］、超臨界CO2萃取法［8］、超聲提取法［9］和離子交換法［10］等。本實驗以乙醇為提取溶劑，采用超聲波提取檸檬皮渣中的苦素類物質，并運用響應曲面法優化工藝條件，以期提高檸檬皮渣中苦素的得率，為開發柑橘類果皮渣中的苦素類物質提供有益參考。

1 實驗部分

1.1 儀器與材料

UVmini-1240 紫外可外分光光度計(日本島津公司);KQ-400KDB 型高功率數控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);CP2202S 電子分析天枰(賽特利斯(北京)有限公司)。

檸檬苦素標樣(西安開來生物工程有限公司，檸檬苦素，含量大于等于98%);無水乙醇、甲醇、二氯甲烷、濃硫酸、香草醛等化學試劑均為國產分析純試劑;檸檬采自四川安岳。

1.2 實驗方法

1.2.1 檸檬皮渣苦素的提取

稱取檸檬粉末5 g，置錐形瓶中加入一定量和一定濃度的乙醇(用保鮮膜包住瓶口)，50 ℃下超聲波(400 W)處理一定時間。處理后抽濾，用少量乙醇清洗燒杯，清洗液一并過濾，濾液濃縮至干，用約40 mL 二氯甲烷溶解燒瓶中的殘余物，轉移至50 mL 容量瓶中二氯甲烷定容至刻度，得待測提取液。

1.2.2 檸檬苦素標準曲線的制備

精確稱取檸檬苦素標準品10 mg(精確到0.00001 g)，用二氯甲烷溶解并定容至50 mL，得質量濃度為0.2 mg/mL 的標準溶液。分別取檸檬苦素標準溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL 于10 mL 容量瓶中，用二氯甲烷定容得標準系列濃度分別為0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 mg/mL。取1.4 mL 0.10 mg/mL 的檸檬苦素標準溶液于試管中，加入0.4 mL 0.02 g/mL 香草醛乙醇溶液振蕩混勻，靜置2 min，加入濃硫酸0.6 mL，迅速振蕩10 s，加入2.5 mL 甲醇溶液混勻顯色，二氯甲烷定容至5 mL，靜置10 min，在300～700 nm 處進行光譜掃描，觀察最大吸收峰波長為547 nm。測定標準系列濃度的吸光度，用最小二乘法作線性回歸，得檸檬苦素濃度C與吸光度值A 的標準曲線回歸方程為:C=0.223A-0.036，R=0.9981。

1.2.3 檸檬苦素提取得率計算

取1.4mL 檸檬苦素提取液于試管中，按上述方法顯色并測定吸光度，計算檸檬苦素提取率。檸檬苦素提取率=C×V/m=C×50/5(mg/g)。

1.2.4 實驗設計

在查閱參考文獻及前期預實驗的基礎上，本文主要考察乙醇濃度、提取時間、液固比對提取效果的影響，應用Design Expert 7.0.0 軟件，采用Box-Behnken Design 設計實驗方案，以液固比(A)、乙醇體積分數(B)、提取時間(C)為影響因素，苦素提取率(Y)為響應值設立處理組，因子編碼及水平見表1。

表1 實驗因素與水平Table 1 Factors and levels of experiments

2 結果與討論

2.1 實驗結果及數據處理

共設計17個處理組，實驗設計及結果見表2。

表2 Box-Behnken 設計方案及響應值Table 2 Box-Behnken experimental design and response values

用Design Expert 7.0.0 軟件將表2 中試驗數據進行多元回歸擬合，得到檸檬苦素提取率對液固比(A)、乙醇濃度(B)、提取時間(C)的二次多項式回歸模型。對所建立的響應模型進行方差分析，結果見表3。由表3 可知，試驗選用的模型高度顯著(P＜0.01)，說明該模型擬合程度良好，可以用此模型來分析以乙醇為溶劑采用超聲波對檸檬皮渣苦素的提取。

表3 回歸模型方差分析Table 3 Analysis of variance for regression model

回歸模型系數顯著性檢驗結果見表4。由表4可知，模型一次項A、C 較顯著(P＜0.1)，二次項B2和C2顯著(P＜0.01)，其他不顯著(P ＞0.1)。

表4 回歸模型系數顯著性檢驗Table 4 Analysis of significance for regression coefficient

2.2 響應面分析

響應面圖形是響應值對各因素所構成的三維空間的曲面圖，圖1、圖2 和圖3 為液料比(A)、乙醇濃度(B)、處理時間(C)在其中一個固定時，另外兩個對檸檬皮渣檸檬苦素提取影響曲面圖。比較圖1、圖2 和圖3 的曲面圖可知，液固比(A)、超聲波處理時間(C)對檸檬皮渣檸檬苦素提取的影響較為顯著，表現為曲線較陡峭，乙醇濃度(B)不顯著，表現為曲線相對平滑。可能是檸檬苦素類化合物在400W 超聲波處理下，在乙醇溶液中浸出速度都很大，故提取乙醇濃度的變化對檸檬苦素提取率影響不顯著。比較圖1、圖2 和圖3 的等高線圖可以看出液料比(A)、乙醇濃度(B)、提取時間(C)的交互影響顯著性相似，表現為等高線相對密度相似，這與方差分析結果一致。

圖1 乙醇濃度、液固比及其交互作用對提取率的影響Fig.1 Effects of liquid solid ratio，ethanol concentration and their interactions on the extraction yield

圖2 液固比、提取時間及其交互作用對提取率的影響Fig.2 Effects of liquid solid ratio，extraction time and their interactions on the extraction yield

圖3 乙醇濃度、提取時間及其交互作用對提取率的影響Fig.3 Effects of ethanol concentration，extraction time and their interactions on the extraction yield

圖4 預測值與實驗值相關圖Fig.4 Correlation plot of predicted extraction yield and actual extraction yield

2.3 模型優化與驗證

模型對各實驗號的預測值與實驗值相關圖見圖4，圖4 可以發現大部分樣本點落在45 度的對角線附近，說明模型的預測值與實驗值之間誤差較小，模型能用于檸檬苦素提取率的預測。在選取的各因素范圍內，根據回歸模型通過Design Expert 軟件分析得出，檸檬苦素最佳提取條件為:液固比為16.80∶1，乙醇體積分數為74.55%，超聲波處理時間為36.94 min，提取率理論預測值為1.752 mg/g。而最優工藝條件恰好與表2 中處理號為5、10、11、16 和17的實驗條件相近(液固比為15，乙醇體積分數為70%，超聲波處理時間為35 min)，這5個實驗的提取率分別為1.698、1.725、1.734、1.727 和1.723 mg/g，平均值為1.721 mg/g，平均值與理論預測值為1.752 mg/g 接近，說明響應曲面得出的結論是正確的，即該方程與實際情況擬合很好，響應曲面法適用于檸檬皮渣苦素超聲波提取工藝分析和參數優化。

3 結論

本文利用試驗設計軟件Design Expert，采用Box-Behnken Design 設計實驗方案，分析得出檸檬皮渣檸檬苦素超聲波乙醇提取的最佳工藝條件，在最佳工藝條件下對檸檬皮渣苦素進行提取，不但提取液檸檬苦素含量最高，而且實驗的重現性好，說明響應曲面法得出的結論是正確的，本文得出的檸檬苦素最佳提取工藝具有一定開發價值。

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