葛根素聯合阿侖膦酸鈉對絕經后骨質疏松大鼠氧化應激、炎癥反應及骨代謝的影響

陳文明 胡芯源

萍鄉市人民醫院脊柱外科，江西 萍鄉 337000

絕經后骨質疏松癥(postmenopausal osteoporosis，PMOP)指絕經后女性卵巢功能衰退，雌激素分泌水平下降，骨代謝失衡，導致骨量減少，骨強度下降，骨結構退變，骨脆性增加為特征的一種代謝性骨骼疾病[1]。氧化應激和炎癥反應影響骨細胞的分化、增殖、凋亡，參與骨重建過程和PMOP發生和發展[2]。葛根素(puerarin，Pue)屬于植物雌激素，可以產生雌激素樣活性，具有促進成骨細胞增殖，抑制破骨細胞分化，改善骨代謝，增加骨量，增加骨密度，減少骨吸收，促進骨形成作用[3-4]。本研究通過觀察葛根素聯合阿侖膦酸鈉對絕經后骨質疏松大鼠氧化應激、炎癥因子和骨代謝的影響，探索其潛在的作用機制，為中西醫結合防治PMPO的臨床應用提供理論依據和新思路。

1 材料與方法

1.1 實驗試劑與材料

雌性Wistar大鼠52只，12周齡，未孕，體重230～260 g，由贛南醫學院提供，許可證號：SCXK(贛)2014-0001。葛根素注射液(規格：100 mg/支，國藥準字：H20053739，安康北醫大制藥股份有限公司)，阿侖膦酸鈉片(福善美)(70 mg/片，國藥準字：J20040004，美國默沙東制藥有限公司)，谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、過氧化氫(H2O2)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、轉化生長因子-β(TGF-β)、白介素-1(IL-1)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和白介素-6(IL-6)試劑盒均購于南京建成生物工程研究所，堿性磷酸酶(ALP)、骨鈣素(BGP)、抗酒石酸酸性磷酸酶5b(TRACP5b)、I型膠原羧基末端肽(ICIP)購于武漢華美生物工程有限公司，Lunari DXA型雙能X射線骨密度檢測儀購于美國GE公司。

1.2 方法

1.2.1構建骨質疏松大鼠動物模型：采用“雙側卵巢摘除術”構建絕經后骨質疏松大鼠動物模型[5]。假手術組不切除卵巢，僅在卵巢周圍切除等量脂肪組織，其他操作步驟相同。所有大鼠均飼養于山東中醫藥大學動物實驗室，同等飼養條件：1～2只/籠，恒溫恒濕，人工明暗交替光照，自由飲食水，活動，標準大鼠飼料喂養。

1.2.2分組及藥物處理：造模成功評價標準：造模8周后骨密度(BMD)峰值減少≥2.5 SD(標準差)。SD大鼠造模成功45只，造模成功率約86%。實驗分為假手術組、去卵巢組、A藥組、B藥組、AB藥組。確認造模成功后第2天給予藥物干預，對照組和去勢組：(0.9% Nacl 5 mL/kg/，ih，1次/d)，藥物A組(葛根素 35 mg/kg，ih，1次/d)，藥物B組(福善美 0.5 mg/kg，po，1次/d)，藥物AB組(葛根素 35 mg/kg，ih，1次/d+福善美 0.5 mg/kg，po，1次/d)，連續給藥6周。

1.2.3標本取材：藥物干預6周結束后，水合氯醛腹腔注射麻醉，股動脈取血，4 ℃，3 000 r/min，離心5 min，分離血清，-20 ℃保存。解剖雙下肢股骨，0.9% Nacl沖洗，4%多聚甲醛固定24 h，15%乙二胺四乙酸(EDTA-2Na)脫鈣14 d，骨形態學改變觀察。

1.2.4檢測血清氧化應激指標、炎性因子和骨代謝指標：取出上清液，采用ELISA法檢測各組血清氧化應激指標：MDA、CAT、SOD、GSH，炎性因子指標：TNF-α、TGF-β、IL-6、IL-1，骨代謝指標：ALP、BGP、TRAP-5b、ICIP。所有操作嚴格參照各試劑盒說明書進行操作。

1.2.5檢測骨組織骨密度：取大鼠L5椎體和右側股骨，在LunariDXA型雙能X線吸收掃描儀掃測，采用小物體Discovery Wi掃描模式，用儀器選定興趣區，以2.0 mm×2.0 mm為中心區域，軟件分析計算BMD值。

1.2.6HE染色法觀察骨組織形態學：參照HE染色法操作步驟，制作石蠟切片，脫蠟去水，蘇木素染色，1%鹽酸分化，脫水透明，封片，顯微鏡觀察染色效果。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 各組大鼠血清氧化應激指標比較

去卵巢組大鼠血清SOD和GSH-Px水平較假手術組均顯著降低(P<0.05)，A藥組、B藥組、AB藥組血清水平較去卵巢組均顯著升高(P<0.05)，以AB藥組最高。去卵巢組大鼠血清H2O2和MDA水平較假手術組均顯著升高(P<0.05)，A藥組、B藥組、AB藥組血清水平較去卵巢組均顯著降低(P<0.05)，以AB藥組最低。見表1。

表1 各組大鼠血清氧化應激指標比較Table 1 Comparison of serum oxidative stress indicators of rats between each group

2.2 各組大鼠血清細胞因子指標比較

去卵巢組大鼠血清TNF-α、TGF-β、IL-6和IL-1水平較假手術組均顯著升高(P<0.05)，A藥組、B藥組、AB藥組血清水平較去卵巢組均顯著下降(P<0.05)，以AB藥組最低。見表2。

表2 各組大鼠血清細胞因子指標比較Table 2 Comparison of serum cytokine indexes of rats among various groups

2.3 各組大鼠血清骨代謝指標

去卵巢組大鼠血清ALP、BGP、TRAP-5b、ICIP水平較假手術組均顯著升高(P<0.05)，A藥組、B藥組、AB藥組血清水平較去卵巢組均顯著下降(P<0.05)，以AB藥組降低。見表3。

表3 各組大鼠血清骨形成生化指標比較Table 3 Comparison of biochemical indicators of serum bone formation between each group of rats

2.4 各組大鼠骨組織骨密度比較

去卵巢組大鼠腰椎和股骨BMD較假手術組顯著降低(P<0.05)，A藥組、B藥組、AB藥組骨組織BMD較去卵巢組均顯著升高(P<0.05)，以AB藥組最高。見表4。

2.5 各組大鼠股骨骨形態學改變

假手術組骨皮質正常，骨板層結構整齊，骨小梁數較多，排列有序；去卵巢組呈骨質疏松樣改變，骨皮質明顯變薄，骨板層結構不整齊，骨小梁明顯稀疏，排列紊亂，髓腔明顯擴大；A藥組和B藥組骨皮質松質骨改變，骨小梁較前增多，小梁稍細但排列尚規則，間距稍寬，髓腔較前變小。AB藥組骨皮質松質骨輕微改變，骨小梁明顯增多，排列規則，間距變窄，連續性、完整性較好，髓腔明顯變小。見圖1。

表4 各組大鼠骨組織BMD比較

圖1 各組大鼠股骨形態結構變化(×40)A：假手術組；B去卵巢組；C：A藥組；D：B藥組；E：AB藥組Fig.1 Morphological changes of the femur in each group (× 40)A: Sham operation group; B Ovariectomy group; C: Drug group A; D: Drug group B; E: AB drug group

3 討論

雌激素水平下降被認為導致PMOP的主要機制，然而補充雌激素骨質疏松癥并未得到明顯改善，單一將雌激素缺乏作為骨質疏松的發病機制不夠完善[6]。研究發現氧化應激和炎性細胞因子參與PMOP的發生、發展，雌激素對骨質疏松的防治作用可能與其全身抗氧化、抗炎作用有關[7]。雌激素的分泌減少、活性氧(reactive oxygen species，ROS)的增加、炎性因子分泌增加是PMOP的重要原因[8]。葛根素作為天然植物葛根中提取分離出的一種單體異黃酮類化合物，對骨產生類雌激素樣作用，可改善骨代謝；而且還能增加骨密度和骨礦含量，改善骨生物力學性能[9]。阿侖膦酸鈉作為第3代二膦酸鹽(BPs)類藥物，可抑制骨吸收、降低骨轉換、預防骨量丟失和減少骨折發生[10]。

絕經后雌激素缺乏機體內積累過多的ROS通過調控多種細胞因子、酶活性和受體配體的表達，促進成骨細胞的凋亡和破骨細胞的增殖及分化，使骨形成小于骨吸收，骨重建失衡[11]。本研究結果顯示絕經后骨質疏松大鼠血清SOD和GSH-Px顯著降低，H2O2和MDA水平均顯著升高，氧化應激反應參與PMOP的發生發展過程，而葛根素聯合阿侖膦酸鈉能夠顯著減少脂質過氧化代謝產物H2O2和MDA的表達，增加抗氧化酶SOD和GSH-Px的活性，最終減輕氧化應激誘導的損傷。初步表明葛根素聯合阿侖膦酸鈉通過抑制氧化應激反應發揮對骨質疏松的改善作用。葛根素具有清除成骨細胞氧自由基、活性氧，發揮抗氧化作用，促進骨細胞增殖、分化和礦化功能[12]。葛根素能提高機體SOD和GSH-Px活性，降低H2O2和MDA含量，保護機體免受氧化應激損傷[13]。

絕經后雌激素水平降低可通過介導一系列細胞因子(如IL-1、IL-6、TNF-α、TGF)等的分泌增多，促進破骨細胞增殖和增強活性，參與骨重建，打破骨形成與骨吸收的動態平衡，導致PMOP[14]。本研究發現絕經后骨質疏松大鼠血清TNF-α、TGF-β、IL-6、IL-1被大量釋放，說明炎性反應在PMOP的發生發展中發揮重要作用。葛根素聯合阿侖膦酸鈉能夠降低血清TNF-α、TGF-β、IL-6和IL-1水平，有效抑制炎性反應；初步表明葛根素聯合阿侖膦酸鈉對骨質疏松癥的改善作用，伴隨炎性反應改變。羅琳等[15]研究發現葛根素聯合阿侖膦酸鈉降低絕經后骨質疏松癥患者血清骨代謝指標(BALP、BGP、TRAP-5b)和免疫因子(IL-10、IL-6、TNF-α)水平。

骨代謝主要由破骨細胞介導的骨吸收和成骨細胞介導的骨形成構成，骨代謝可及時反映機體內骨轉換狀態，骨代謝、骨重建的變化[16]。本研究顯示葛根素聯合阿侖膦酸鈉抑制氧化應激和炎性反應，調節血清骨代謝ALP、BGP、TRAP-5b、ICIP等指標，從而提高腰椎和股骨BMD，改善骨組織形態學結構，發揮抗骨質疏松作用。有研究發現葛根素聯合阿侖膦酸鈉通過減輕老年骨質疏松患者炎癥反應和氧化應激，改善骨質代謝，增加骨密度，臨床治療效果顯著[17]。

綜上所述，本研究初步表明葛根素聯合阿侖膦酸鈉具有協同抑制減輕絕經后骨質疏松大鼠氧化應激和炎癥反應，降低氧化應激和炎性因子分泌，調節骨代謝，改善骨組織病理形態結構，發揮抗骨質疏松作用。但氧化應激、炎性反應參與骨質疏松的機制尚未完全明確，葛根素和阿侖膦酸鈉聯合可在達到最佳治療效果的同時減少激素用量，從而減少雌激素引起的副作用。因此，探討中西結合防治PMOP是未來研究的重點，同時也為中草藥的應用開辟了新的途徑。