溫腎壯骨方對乳腺癌骨轉移Tac1/NK1R 通路蛋白的影響

張小慧， 韓向暉 ， 劉 勝， 郭保鳳， 王春麗， 韓 偉

(1. 華東理工大學中藥現代化工程中心，上海200237;2. 上海中醫藥大學附屬龍華醫院中醫外科研究所，上海200032)

骨是乳腺癌常見的遠處轉移部位，超過70%的乳腺癌病人可發生骨轉移。乳腺癌骨轉移的發病率和死亡率很高，中位生存期僅為2 年［1］。防治骨轉移仍是乳腺癌治療的重點和難點。盡管常規的放、化療、內分泌治療和雙磷酸鹽療法取得了一定的療效，但都沒有從根本上解決乳腺癌骨轉移問題［2］。骨髓微環境中間充質干細胞(bone marrow stem cells，BMSCs)與乳腺癌細胞之間的相互作用是乳腺癌細胞進入并整合到骨髓的重要因素，前速激肽原1 (Preprotachykinin-1，Tac-1)/神 經 激 肽1 受 體 (Neurokinin1 receptor，NK1R)通路是調節這種相互作用的關鍵途徑［3］。臨床研究表明，溫腎壯骨方配伍經驗協定方—乳癌術后方能顯著改善患者骨痛癥狀，減少骨相關事件發生率、延緩溶骨性病變，穩定其生活質量。實驗研究也證實溫腎壯骨方可以抑制乳腺癌細胞生長、遷移，調節破骨細胞與成骨細胞間分化平衡，阻止骨轉移的發展。

本研究通過進一步觀察溫腎壯骨方對乳腺癌骨轉移裸鼠Tac1/NK1R 通路相關分子Tac-1、NK1R、stromal cell derived factor-1α (SDF-1α)、CXCR4 蛋白表達的影響，以期揭示該方干預乳腺癌骨轉移的的機制，為中醫藥防治乳腺癌骨轉移提供一定的實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物及細胞株 免疫缺陷BALB/c 裸鼠50只，雌性，體質量18 ～24 g，由上海西普爾-必凱實驗動物有限公司提供，動物許可證號:SCXK(滬)2008-0016。

人乳腺癌骨高轉移細胞株MDA-MB-231BO 由美國德克薩斯州立大學醫學系內分泌所Toshiyuki Yoneda 博士惠贈，在含10 %胎牛血清，50 kU/L青霉素及50 mg/L 鏈霉素的DMEM 高糖培養基中，37 ℃，5%CO2環境下培養。

1.1.2 藥物及試劑 溫腎壯骨方，由補骨脂，蛇床子，制附子組成(原方比例為5 ∶5 ∶3)，由龍華醫院藥劑科制備。所有藥材按比例混合，常規方法浸泡4 h，煎煮兩次，每次1.5 h ，過濾、濃縮制備成含生藥量7.1 g/g 的流浸膏(含補骨脂素9.18 mg/g 浸膏，蛇床子素6.05 mg/g 浸膏)，批號120710。羊抗人Tac-1 和NK1R 多克隆抗體，兔抗人SDF-1α 和CXCR4 多克隆抗體(美國Santa Cruz公司)，其余試劑均為分析純。

1.1.3 主要儀器 TP1020 全自動組織脫水機(德國Leica 公司);EG1160 石蠟包埋機(德國Leica公司);RM2265 輪轉式切片機 (德國Leica 公司);IX71 熒光倒置顯微鏡 (日本OLYMPUS 公司);JVC TK-C1481BEC 彩色攝像機，CX31 生物顯微鏡(日本OLYMPUS 公司)等。

1.2 方法

1.2.1 分組、造模與給藥 參照課題組前期方法，建立和臨床接近的乳腺癌骨轉移動物模型。選用6 ～8 周齡雌性裸鼠每只左心室接種親骨性乳腺癌高轉移細胞株MDA-MB-231BO 細胞懸液 (107個/mL)造模，每只0.1 mL。裸鼠接種24 h 后稱定質量，按體質量分層隨機分為:模型對照組(移植瘤，灌胃生理鹽水)，溫腎壯骨方高、中、低劑量組(移植瘤，給藥劑量分別為3.75，7.5，15 g/(kg · d)，唑來磷酸組 (移植瘤，100 μg/kg)，每組10 只。造模后1 周開始給藥，中藥組灌胃給藥，每日1 次，唑來磷酸組腹腔注射，每周1 次，連續6 周。末次給藥后1 h 處死小鼠，無菌條件下選取各組腫瘤骨轉移灶，4%多聚甲醛中固定24 h，10% EDTA 溶液進行骨組織脫鈣10 d后，待骨質變松后，石蠟包埋、切片，行常規HE染色，光鏡下觀察轉移組織的形態學變化。

1.2.2 免疫組化法檢測骨轉移組織中Tac-1、NK1R、SDF-1α、CXCR4 蛋白的表達 骨轉移病灶組織在4%多聚甲醛中固定16 h，石蠟包埋、切片，58 ℃烤24 h;石蠟切片常規脫蠟至水，PBS洗3 ×3 min;用0.01 mol/L 枸櫞酸鹽緩沖液(pH 6.0)中加熱至96 ～100 ℃，持續20 min，室溫自然冷卻，PBS 洗3 ×3 min;滴加EDTA 抗原修復液，95 ℃置10 min，PBS 洗2 min ×3 次;室溫加入0.3%H2O2抑制內源性過氧化物酶20 min，PBS洗3 × 3min;滴加20% 正常羊血清室溫封閉30 min;滴加羊抗人Tac-1 和NK1R 多克隆抗體，兔抗人SDF-1α 和CXCR4 多克隆抗體，37 ℃孵育2 h，PBS 洗3 ×3 min;滴加EnVision 試劑(HRP/R)37 ℃孵育30 min，PBS 洗3 ×3 min;DAB 顯色8 ～12 min;蘇木素襯染色，熱水藍化;吹干后，樹脂封片;鏡下觀察，核紫藍色，陽性呈棕黃色，胞漿內陽性。所有切片均在同一條件的光學顯微鏡下觀察，每張切片選取5 個視野，應用Image-Pro Plus 6.0 醫學圖像定量分析系統測定陽性部位總吸光度值和總面積值，計算二者比值即陽性表達部位的平均光密度值。

2 結果

2.1 骨組織病理形態學觀察 造模10 周后，模型對照組動物多部位出現骨轉移灶，而溫腎壯骨方組及陽性對照組骨轉移灶部位數明顯減少，見圖1。各組骨轉移灶病理學檢查顯示，模型對照組骨髓腔出現明顯異型性腫瘤細胞彌漫性浸潤，原正常骨組織結構發生破壞，呈現溶骨性病變。溫腎壯骨方組及陽性對照組骨髓腔中腫瘤細胞浸潤減輕，骨組織損傷情況明顯緩解，骨基質邊緣及骨小梁周邊成骨細胞數目較模型對照明顯增多(見圖2)。提示溫腎壯骨方對裸鼠乳腺癌骨轉移具有一定的治療作用。

圖1 裸鼠骨轉移灶部位數Fig.1 Number of metastatic bone

圖2 乳腺癌骨轉移組織的病理形態學觀察Fig.2 Morphological changes in bone metastasis tissues of breast cancer

2.2 免疫組化檢測骨轉移灶中Tac1/NK1R 通路相關蛋白Tac-1、NK1R、SDF-1α、CXCR4 的表達Tac-1、NK1R、SDF-1α、CXCR4 蛋白陽性表達細胞以胞質呈棕黃色或棕褐色為主，胞核也有少量表達。與模型對照組比較，溫腎壯骨方各劑量組骨轉移灶中的SDF-1α、CXCR4 蛋白表達明顯降低(P ＜0.05 或P ＜0.01)，溫腎壯骨方組高、中劑量組骨轉移灶中的Tac-1、NK1R 的蛋白表達較模型對照組明顯降低(P ＜0.05 或P ＜0.01);與模型對照組比較，唑來膦酸組骨轉移灶中的Tac-1、CXCR4 的蛋白表達明顯降低(P ＜0.05 或P ＜0.01)。實驗結果提示，溫腎壯骨方可能通過下調Tac-1、NK1R、SDF-1α、CXCR 蛋白的表達抑制乳腺癌骨轉移(見圖3 ～4)。

3 討論

存在于骨髓微環境中具有多向分化潛能的BMSCs 與腫瘤的發生、發展密切相關。BMMSCs 和乳腺癌細胞能通過Tac1/NK1R 信號通路，啟動G 蛋白耦聯受體信號通路，調控SDF-1α-CXCR4 生物軸，最終誘導乳腺癌細胞的骨侵襲和轉移。在Tac1/NK1R 信號通路中Tac-1 基因被認為是調控乳腺癌早期階段癌細胞向骨髓侵襲、轉移的啟動基因，并且在乳腺癌細胞和間充質干細胞間的相互作用中起著整合的作用。它不僅能通過其編碼產物調控BMSCs 和乳腺癌細胞中SDF-1α 和CXCR4 的表達，影響兩種細胞的結合、黏附及轉移，而且能介導骨內膜區的癌細胞過渡到靜止亞型，后者更容易生存在骨髓的微環境中并且對化療耐受［4-5］。SP 是Tac-1 基因最主要的編碼產物，它能通過旁分泌方式上調并激活細胞膜上的速激肽受體(如NK1 受體)刺激乳癌細胞的增殖，傳遞抗輻射性、減少乳腺癌細胞凋亡、誘導生長因子和促血管生成因子分泌及促進乳腺癌細胞向骨的轉移［6-7］。

圖3 各組骨轉移組織中Tac1/NK1R 通路相關蛋白的表達(immunohistochemical stain，×200)Fig.3 Expressions of related proteins in bone metastatic tissues of breast cancer after the treatment with WSZG recipe (immunohistochemical stain，×200)

圖4 Tac1/NK1R 通路各蛋白陽性表達的平均光密度值Fig.4 Effect of WSZG recipe on related protein expressions in Tac1/NK1R signaling pathway

骨轉移瘤屬中醫骨痹、骨蝕等范疇［8］。中醫學認為腎主骨主髓，關于腎與骨之間的關系，古文獻中早有記載，《素問·宣明五氣篇》:明確指出“腎主骨”。乳腺癌骨轉移發病機制為本虛標實，腎陽虧虛是發生骨轉移之本，治療當以溫腎為主。臨床針對乳腺癌骨轉移的患者，多在祛邪中藥基礎上加用補骨脂、蛇床子、骨碎補等補腎之品，以壯骨通陽，并佐以炙乳香、附子、細辛溫陽散寒止痛。本課題組臨床小樣本的回顧性隊列研究發現，“乳癌術后方”配伍“溫腎壯骨方”治療乳腺癌骨轉移患者50 例，能顯著改善患者骨痛癥狀，減少骨相關事件發生率及延緩溶骨性病變，并對乳腺癌骨轉移顯示出良好的抑制作用［9］。實驗研究發現，補骨脂-蛇床子溫腎藥對能夠抑制乳腺癌細胞生長，抑制乳腺癌骨轉移造成的溶骨性惡性循環［10］。不同配伍比例的補骨脂-蛇床子藥對均能抑制親骨性乳腺癌高轉移細胞MDA-MB-231BO 的遷徙活性，刺激骨髓間充質干細胞向成骨細胞轉化，減少破骨細胞分化，從而阻止了骨轉移的發展［11］。

本研究采用左心室接種親骨性乳腺癌高轉移細胞株MDA-MB-231BO 細胞懸液建立乳腺癌骨轉移裸鼠模型。造模4 周后，模型動物即出現多處骨轉移病灶，鏡下觀察骨組織結構發生破壞，骨髓腔中腫瘤細胞浸潤明顯，表明造模成功。經過溫腎壯骨方治療6 周后，高、中劑量組動物骨轉移損傷情況明顯減輕，且成骨細胞數多于模型對照組。免疫組化結果顯示，溫腎壯骨方各劑量組能夠不同程度下調骨轉移灶中Tac1/NK1R 通路相關蛋白的表達，其中高、中劑量溫腎壯骨方能夠明顯降低Tac-1、NK1R、SDF-1α、CXCR4 4 種蛋白的表達，作用最強。

以上結果表明，溫腎壯骨方能減輕裸鼠乳腺癌細胞骨轉移程度，其機制可能與下調Tac1/NK1R通路相關蛋白表達有關。這些研究為臨床應用該方治療乳腺癌骨轉移提供一定的實驗依據。

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