羚羊感冒片中4 種有效成分的定量分析及不確定度評定

牟英迪， 黃寶群， 蓋 成， 林吉茂

(1. 濟南市食品藥品檢驗檢測中心，山東 濟南250001;2. 山東電力中心醫院，山東 濟南250001;3. 山東大學化學與化工學院，山東濟南250100)

有效成分的定量分析是現代藥學研究和藥物質量控制領域的重要研究方向之一，定量分析結果的可靠性直接決定了藥物的安全性和有效性［1］。測量不確定度是與測量結果相關聯的一個參數，用以表征合理地賦予被測量之值的分散性［2］。測量不確定度在分析化學包括藥物檢測領域得到了深入的研究和廣泛的應用［3-8］。一份完整的檢測報告中，應該包含不確定度的評定報告，通過有限次數測量，以及經驗、資料等信息實現可操作性，是經典誤差理論的發展和完善［9］。

羚羊感冒片收載于《中國藥典》2010 年版一部［10］，由羚羊角、牛蒡子、淡豆豉、金銀花、荊芥、連翹、淡竹葉、桔梗、薄荷油、甘草組方，具有清熱解表的功效，用于流行性感冒、發熱惡風、頭痛頭暈、咳嗽、胸悶、咽喉腫痛等癥。檢驗標準中在含量測定限下僅對牛蒡苷進行測定。本實驗采用程序可變波長HPLC 法，對羚羊感冒片中牛蒡苷、綠原酸、連翹苷與甘草酸銨的量進行測定，并根據國家質量技術監督局發布的《測量不確定度評定和表示》 (JJF1059-1999)［11］和《Quantifying Uncertainty in Analytical Measurement》［12］，對檢測結果的可靠性進行評估，為評價分析方法、評定試驗室及分析測試人員的技術水平和準確判斷羚羊感冒片質量提供依據。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Agilent1200 高效液相色譜儀;UV-2550型紫外-可見分光光度計(日本島津公司);梅特勒AE-240 型電子分析天平(十萬分之一);梅特勒AE-100 型電子分析天平(萬分之一);SK2200LH 超聲波清洗器(上海科導超聲儀器有限公司)。

1.2 試藥 甲醇、乙腈(天津四友生物醫學技術開發公司，色譜純);水為重蒸餾水;其余試劑均為分析純;牛蒡苷(批號110819-201007，純度為95.4%);綠原酸(批號110753-200413);連翹苷(批號110821-200610);甘草酸銨(批號1107317-200513)對照品均購自中國藥品生物制品檢定所;羚羊感冒片(北京同仁堂科技發展股份有限公司制藥廠，批號1120665)。

2 方法學考察

2.1 色譜條件 XDB-C18色譜柱 (250 mm ×4.6 mm，5 μm);流動相為乙腈(A)-0.05 mol/L磷酸二氫鉀溶液(B)按表1 程序進行梯度洗脫。體積流量0.85 mL/min，柱溫25 ℃，進樣量10 μL。在該色譜條件下，4 種待測組分與其他組分達到基線分離，各待測組分的理論板數均不低于2 000。

表1 梯度洗脫程序Tab.1 Mode of gradient elution

2.2 混合對照品溶液的制備 分別精密稱取牛蒡苷、綠原酸、連翹苷、甘草酸銨對照品13.97、10.50、8.70、2.53 mg 置100 mL 量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，制成各對照品單標溶液。精密移取各單標溶液10 mL 置50 mL 量瓶中，加50%甲醇稀釋至刻度，作為混合對照品貯備液，備用。

2.3 供試品溶液的制備 取本品20 片，研成細粉，取1.27 g，精密稱定，置100 mL 量瓶中，加50%甲醇溶解并稀釋至刻度，濾過，取續濾液10 mL置50 mL 量瓶中，加50%甲醇稀釋至刻度，作為供試品溶液。

2.4 陰性對照溶液的制備 按處方比例制備不含牛蒡苷、綠原酸、連翹苷與甘草酸銨的樣品，再按“2.3”項下方法制備得到陰性對照溶液。

2.5 專屬性試驗 分別量取10 μL 混合對照品溶液、供試品溶液、陰性對照溶液注入液相色譜儀，按“2.1”項下的色譜條件分別測定，得到混合對照品、供試品溶液和陰性溶液的HPLC 圖，見圖1。結果顯示陰性樣品對羚羊感冒片樣品測定無干擾。

圖1 HPLC 圖譜Fig.1 HPLC chromatograms

2.6 線性關系考察 精密吸取混合對照品溶液1、2、4、8 mL 置10 mL 量瓶中，將上述混合對照品溶液和對照品貯備液按“2.1”項下的色譜條件測定，記錄保留時間和峰面積，以質量濃度C 與其相應的峰面積A 求得回歸方程與相關系數。結果牛蒡苷的線性方程為A =86.082C -14.039，r2=0.999 6，在2.665 ～26.65 μg/mL 范圍內呈良好的線性關系;綠原酸的線性方程為A = 93.983C -5.969 6，r2=0.999 7，在2.100 ～21.00 μg/mL 范圍內呈良好的線性關系;連翹苷的線性方程為A=100.39C-23.205，r2=0.999 2，在1.740 ～17.40 μg/mL 范圍內呈良好的線性關系;甘草酸銨的線性方程為A =109.27C +1.8329，r2=0.999 5，在0.506 0 ～5.060 μg/mL 范圍內呈良好的線性關系。

2.7 精密度試驗 精取同一混合對照品溶液，進樣量10 μL，重復進樣6 次(n=6)，記錄峰面積。牛蒡苷、綠原酸、連翹苷與甘草酸銨的峰面積RSD 分別為0.5%、0.6%、0.8%與1.0%，表明儀器精密度良好。

2.8 穩定性試驗 取本品細粉1.276 3 g，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，分別于配制后0、4、8、12、16 h 后進樣測定，觀察供試品溶液穩定性，樣品中牛蒡苷、綠原酸、連翹苷與甘草酸銨峰的峰面積積分值基本穩定不變，RSD 值分別為0.8%、0.9%、0.9% 與1.1%，表明樣品溶液在16 h 內穩定性良好。

2.9 回收率試驗 采用加樣回收率法，取已知含有量的供試品溶液9 份，分別定量加入4 種對照品，按“2.3”項下方法制備供試品溶液并進行測定，以50 mL 中的絕對含有量計算加樣回收率。結果牛蒡苷的回收率為100.2%，RSD 為0.6%;綠原酸為99.8%，RSD 為0.7%;連翹苷為99.7%，RSD 為0.8%;甘草酸銨為100.3%，RSD 為0.9%，表明該方法回收率良好。

3 數學模型

在本研究中，羚羊感冒片中牛蒡苷、綠原酸、連翹苷和甘草酸銨4 種指標性成分含有量計算公式:

4 不確定度來源的識別及分析

4.1 不確定度的來源 從檢測過程和數學模型分析，樣品中4 種組分含有量的相對標準不確定度urel來源，主要包括①對照品稱樣與溶液配制過程引入相對標準不確定度;②供試品稱樣與溶液配制過程引入相對標準不確定度;③HPLC 測定峰面積響應值的相對標準不確定度;④其他因素引入的不確定度分量。

4.2.1 對照品純度的標準不確定度 實驗中所使用的牛蒡苷、綠原酸、連翹苷與甘草酸銨由于尚無法得到相關的不確定度參考值，故此項忽略不計。

通過計算，各對照品在稱量過程所產生的相對標準不確定度分別為urel(M牛) = 1.23 × 10-3;urel(M綠) = 1.55 × 10-3;urel(M連) = 1.87 ×10-3;urel(M綠) =6.44 ×10-3。

4.2.4 平均片重引入的不確定度分量 平均片重由稱定20 片樣品質量，計算平均值得到。其不確定度分析與樣品稱量相同。20 片的片重為10.176 0 g，平均片重為508.8 mg。所以平均片重標準不確定度為

表2 稀釋過程玻璃量器校準和溫度變化引入的標準不確定度Tab.2 Uncertainty introduced by glass gauge calibration and temperature variation during dilution

4.2.9 合成標準不確定度 根據計算公式，將以上各相對不確定度分量合成，得到羚羊感冒片中分別以牛蒡苷、綠原酸、連翹苷、甘草酸銨計算的量(X)相對標準不確定度:

5 擴展不確定度

取置信概率為95%，包含因子K =2，則相對擴展 不 確 定 度 為 U (X) = 2 × ux，U(牛)=0.024 mg，U(綠)=0.028 mg，U(連)=0.034 mg，U(甘)=0.022 mg。

6 測量結果報告

結合上述測量結果及不確定度評定過程，由表3 可以看出，樣品中含牛蒡苷X牛= (1.67 ±0.02)mg/片;X綠= (2.03 ± 0.03) mg/片;X連=(2.34 ± 0.03)mg/片;X甘= (1.07 ± 0.02)mg/片。

表3 樣品測定結果及不確定度Tab.3 Contents and uncertainty of the samples

7 討論

經二極管陣列檢測器全波長掃描，各待測物質最大吸收波長分別為綠原酸326 nm，連翹苷280 nm，牛蒡苷280 nm，甘草酸銨234 nm。因此選擇采用程序波長法，在不同的時間段進行波長切換檢測。

由評定過程可知，除去色譜儀本身的不確定度分量外，方法的準確性、稱量過程、稀釋過程對合成不確定度貢獻較大。因此，在方法的開發中應注意方法的準確性考察;樣品測量方面，要注意樣品的均勻性和樣品處理過程的一致性;稀釋樣品時盡可能選用容量相對大的量具并盡可能減少稀釋步驟。

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