RP-HPLC 法測定黃芪及玉屏風顆粒中4 種異黃酮類成分

周 倩， 李 瑩 ， 戴衍朋， 沈秀娟， 孫立立

(山東省中醫藥研究院，山東 濟南 250014)

黃芪為豆科植物蒙古黃芪Astragalus membranaceus (Fisch.)Bge. var. mongholicus (Bge.)Hsiao或膜莢黃芪Astragalus membranaceus (Fisch)Bge.的干燥根［1］。黃芪性溫，味甘，歸肺、脾經，具有補氣固表、利尿托毒、排膿、斂瘡生肌的功效，為臨床經典補益中藥。玉屏風顆粒是以黃芪為主藥的經典方劑，具有益氣、固表、止汗等功效，在改善免疫力方面具有較顯著的效果［2-3］。黃芪主要成分包括皂苷、黃酮、多糖、氨基酸等［4-8］，其中黃酮類成分文獻報道具有顯著的預防和治療心血管疾病，抗氧化，抗衰老以及增強機體免疫等功能［9］，為黃芪主要活性成分之一。《中國藥典》2010 年版僅對黃芪黃酮中毛蕊異黃酮苷的量進行了規定［1］，對玉屏風顆粒中黃酮類成分未作要求。通過查閱文獻發現，目前研究中對玉屏風制劑中黃芪黃酮類成分進行定量測定的報道也較少［10-11］。本實驗通過研究建立了黃芪飲片及其復方玉屏風顆粒中毛蕊異黃酮、芒柄花素、毛蕊異黃酮苷、芒柄花苷4 種黃酮類成分的定量測定方法。一方面可為黃芪飲片及其制劑的質量控制提供更全面的質量評價指標，同時通過對黃芪飲片與玉屏風顆粒中各成分的量比較，考察復方配伍對黃芪中黃酮類成分提取率的影響。

1 儀器和試藥

1.1 儀器 Waters600 高效液相色譜儀，996 二極管陣列檢測器，十萬分之一電子天平 (Sartorius R200D，德國);HH-4 型數顯恒溫水浴鍋(金壇市晶玻試驗儀器廠);RE-2000 型旋轉蒸發器(上海亞榮生化儀器廠)。

1.2 試藥與試劑 乙腈為色譜純，水為超純水，其他試劑均為分析純。毛蕊異黃酮苷 (批號120312)、芒柄花苷(批號120415)、毛蕊異黃酮(批號120519)、芒柄花素(批號120530)均購自上海麗臣商貿有限公司，純度均＞98%。

1.3 供試樣品 黃芪飲片，產地甘肅。經本院中藥資源開發研究室林慧彬研究員鑒定為豆科植物蒙古黃芪Astragalus membranaceus (Fisch.)Bge. Var.mongholicus (Bge.)Hsiao 或膜莢黃芪Astragalusmembranaceu s (Fisch.)Bge 的干燥根。市售玉屏風顆粒，生產廠家為廣東環球制藥有限公司，批號分別為121216 和130313。

2 試驗方法與結果

2.1 玉屏風顆粒制備 照《中國藥典》2010 年版收載玉屏風顆粒【制法】項下方法制備:取防風200 g，酌予碎斷，提取揮發油，蒸餾后水液另器收集;藥渣及其余二味 (黃芪600 g，炒白術200 g)加水煎煮二次，第一次1.5 h，第二次1 h，合并煎液，濾過，濾液濃縮至適量，加乙醇至含醇量為70%，攪拌，靜置，濾過，濾液濃縮至為清膏，加輔料制成顆粒，干燥，放冷，噴加上防風揮發油，混勻，制成約500 g，即得。

2.2 色譜條件［12］Phenomenex Luna C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm);以乙腈(A)-0.1%磷酸水溶液(B)為流動相梯度洗脫(0→8 min，20%A→30%A;8→16 min，30%A→45%A;16→20 min，45% A →60% A;20 →23 min，60% A →100% A;23 →30 min，100% A);體 積 流 量1.0 mL/min;檢測波長251 nm，柱溫25 ℃。

2.3 對照品溶液的制備 分別精密稱取各對照品適量，置同一量瓶中，加甲醇制成含毛蕊異黃酮苷0.066 mg/mL、芒柄花苷0.033 mg/mL、毛蕊異黃酮0.035 mg/mL、芒柄花素0.017 mg/mL 的混合溶液。

2.4 樣品溶液制備 取黃芪粉末(過40 目篩)約1 g，精密稱定，置圓底燒瓶中，精密加入甲醇50 mL，加熱回流提取40 min，放冷，再稱定質量，用甲醇補足失減質量，搖勻，濾過，濾液減壓回收至干，殘渣加甲醇溶解并定容至10 mL量瓶中，混勻，過0.45 μm 微孔濾膜，即得黃芪供試品溶液。

取玉屏風顆粒約1 g，精密稱定，同法制成玉屏風顆粒供試品溶液。

2.5 系統適用性試驗 在上述色譜條件下，分別精密吸取對照品溶液和供試品溶液各10 μL 注入液相色譜儀，測定。結果對照品峰與其他峰均可達到基線分離，且保留時間適中。供試品保留時間和峰形均與對照品一致，說明該分析條件良好。見圖1。

2.6 線性關系考察 取對照品溶液，進樣量依次為2、4、8、10、12 μL，測定峰面積，以進樣量(μg)為橫坐標，峰面積為縱坐標，進行線性回歸，得回歸方程，毛蕊異黃酮苷為Y =13 429.66X +47.60，r =0.999 6，線性范圍0.132 ～0.792 μg;芒柄花苷為Y = 20 871.58 X - 133.61，r =0.999 3，線性范圍0.066 ～0.396 μg;毛蕊異黃酮為Y=25 316.25X-12.56，r =0.999 8，線性范圍0.07 ～0.42 μg;芒柄花素為Y = 32 969.97X -37.21，r=0.999 9，線性范圍0.034 ～0.204 μg。

2.7 精密度試驗 精密吸取對照品溶液10 μL，連續進樣5 次，測定峰面積值，結果毛蕊異黃酮苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮和芒柄花素峰面積的RSD 分別為0.9%、1.1%、1.0%、0.8% (n =5)。表明儀器精密度良好。

圖1 HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms

2.8 穩定性試驗 精密吸取黃芪供試品溶液和玉屏風顆粒各10 μL，分別于0、2、4、8、12 h 進行測定。結果黃芪中毛蕊異黃酮苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮和芒柄花素峰面積的RSD 分別為2.1%、2.6%、1.6%和1.5%。玉屏風顆粒中4 個成分峰面積的 RSD 依次為 2.0%、2.1%、2.1% 和1.8%。表明兩樣品均在12 h 內穩定。

2.9 重復性試驗 取同一批黃芪樣品和玉屏風顆粒6 份，分別制備供試品溶液，依法測定，結果黃芪中毛蕊異黃酮苷RSD 為1.8%，芒柄花苷RSD為2.3%，毛蕊異黃酮RSD 為2.0%，芒柄花素RSD 為1.8%。玉屏風顆粒中4 個成分的RSD 分別為2.2%、2.0%、2.3%和2.3%。表明本法重復性良好。

2.10 回收率試驗 取已知含有量的黃芪樣品和玉屏風顆粒6 份，各0.5 g，精密稱定，分別精密加入各對照品適量，依法提取測定，計算回收率，結果見表1 和表2。

表1 黃芪飲片加樣回收率試驗結果(n=6)Tab.1 Results of recovery tests for Astragali Radix (n=6)

表2 玉屏風顆粒回收率試驗結果(n=6)Tab.2 Results of recovery tests for Yupingfeng Granules(n=6)

2.11 樣品測定 精密吸取上述樣品及對照品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，照上述色譜條件依法測定，計算，結果見表3，市售玉屏風顆粒測定結果見表4。

表3 黃芪及自制復方中黃酮類成分測定結果Tab.3 Determination results of Astragali Radix and homemade compounds

表4 市售玉屏風顆粒中黃酮類成分測定結果Tab.4 Determination results of Yupingfeng Granules commercially available

3 小結與討論

本研究前期對色譜條件進行了考察，通過對乙腈-水和乙腈-0.1%磷酸等流動相系統的比較，不同柱溫下分離效果的考察，以及不同檢測波長比較，確定以乙腈-0.1%磷酸作為流動相梯度洗脫，檢測波長251 nm，柱溫25 ℃。在優選的色譜條件下，各色譜峰的保留時間適中，分離度較好，且基線穩定。

本研究建立的黃芪飲片及其復方玉屏風顆粒中4 個黃酮類成分的定量測定方法，經方法學考察，表明該方法操作簡便，重復性好，測定結果準確，可用于黃芪及其復方的測定。

采用本方法對玉屏風顆粒以及制備玉屏風顆粒用的同批次黃芪飲片進行了成分比較，結果可見，毛蕊異黃酮和芒柄花素的量在飲片及自制復方中測得的含有量差異不大，而復方中毛蕊異黃酮苷和芒柄花苷量約為黃芪飲片該成分含有量的2 倍左右，分析其原因一方面為在玉屏風顆粒制備過程中，以水作為提取溶劑進行提取，可使極性相對較大的毛蕊異黃酮苷和芒柄花苷煎出率提高，另一方面黃芪與白術和防風混合煎煮提取，可能提高了黃芪中毛蕊異黃酮苷和芒柄花苷兩個成分的溶出率。

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