RP-HPLC 法同時測定寶咳寧顆粒中4 種成分

周 卿， 楊建文， 鄭天宇

(1. 遵義醫學院藥學院，貴州遵義563003;2. 遵義醫學院附屬醫院藥劑科，貴州遵義563003)

寶咳寧顆粒是由黃芩、前胡、枳殼、青黛、麻黃、桑葉等十六味中藥組成，主要用于治療小兒外感風寒、內熱停食引起的頭痛身燒、咳嗽痰盛、咽喉腫痛、煩躁不安等，屬國家中藥保護品種。在現行《中國藥典》2010 年版中僅收載了高效液相色譜法測定黃芩苷［1-2］。為滿足對復雜的中藥復方體系的質量控制要求，選擇多指標的測定可以有效控制產品的質量［3］，故選取了處方中枳殼、黃芩、青黛、前胡四味藥中的代表性成分柚皮苷［4-8］、黃芩苷［9］、靛玉紅［10-12］和白花前胡甲素［13-15］作為檢測指標，建立了高效液相色譜法同時定量測定的方法。

1 儀器與試藥

Agilent 1100 全自動高效液相色譜儀(DAD 檢測器)(美國安捷倫公司);KQ-500DE 型數控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);BT125D十萬分之一電子天平(賽多利斯北京有限公司)。

柚皮苷(批號110722-201111)、黃芩苷(批號 110715-201117 )、靛 玉 紅 (批 號 110717-200204)、白花前胡甲素 (批號111711-200602)對照品均購自中國藥品生物制品檢定所;寶咳寧顆粒(規格:2.5g/袋)購自本地藥材市場;乙腈、甲醇(色譜純，百靈威化學有限公司);重蒸餾水;其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 漢邦Dubhe-C18色譜柱 (4.5 mm× 250 mm，5 μm);流動相為乙腈 (A)-0.05%磷酸水溶液(B)，梯度洗脫(0 min，22%A;7 min，30%A;12 min，60%A;18 ～20 min，95%A);體積流量為1.0 mL/min;柱溫25 ℃;進樣量20 μL;柚皮苷、黃芩苷和靛玉紅檢測波長為280 nm，白花前胡甲素為321 nm。在該色譜條件下，取對照品溶液、供試品溶液和陰性樣品溶液進樣分析，結果顯示柚皮苷、黃芩苷、靛玉紅和白花前胡甲素保留時間分別為6.2、9.2、17.5、19.1 min，樣品中其他組分不干擾測定，分離度均大于1.5，理論塔板數以白花前胡甲素計大于6 000，色譜圖見圖1。

圖1 寶咳寧顆粒的色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of Baokening Granules

2.2 溶液制備

2.2.1 對照品溶液 分別精密稱取柚皮苷、黃芩苷對照品適量，加甲醇制成質量濃度為10.0 mg/mL、1.0 mg/mL 的對照品溶液;精密稱定白花前胡甲素，加甲醇制成質量濃度為1.0 mg/mL 的對照品溶液，并用甲醇稀釋制備0.01 mg/mL 的對照品溶液;精密稱取靛玉紅對照品適量，加丙酮制成質量濃度為1.0 mg/mL 的對照品溶液，置于4 ℃冰箱中保存，待用。

2.2.2 供試品溶液 取寶咳寧顆粒適量，研細，精密稱取該藥細粉1.0 g，加入60%甲醇定容至50 mL，稱定質量，水浴超聲 (功率500 W，40 kHz)提取45 min 后，放置室溫，加60%甲醇補足失去質量，搖勻，經0.45 μm 微孔濾膜過濾，取濾液20 μL 進樣分析。

2.2.3 陰性樣品溶液 按處方比例分別制備缺枳殼、黃芩、青黛、前胡藥材的陰性樣品，依“2.2.2”項下制備陰性樣品溶液。

2.3 線性關系考察 精密吸取“2.2.1”項中所配各對照品溶液適量于10 mL 量瓶中，用甲醇稀釋并定容，配置系列質量濃度的混合對照品溶液，分別取20 μL 在上述色譜條件下進樣分析，以對照品質量濃度(μg/mL)為橫坐標(X)，色譜峰面積為縱坐標(Y)進行線性回歸。得柚皮苷回歸方程為Y ﹦21.29X +69.63，r ﹦0.999 2;黃芩苷為Y﹦68.88 X+ 203.5，r ﹦0.999 1;靛玉紅為Y ﹦27.26 X -0.79，r ﹦0.999 0;百花前胡甲素為Y ﹦1.07 X-3.52，r ﹦0.999 1。

結果表明，柚皮苷在5 ～120 μg/mL，黃芩苷在2 ～60 μg/mL，靛玉紅在0.5 ～5.0 μg/mL，白花前胡甲素在10 ～100 ng/mL 范圍內，與峰面積呈良好的線性關系。最低檢測限以性噪比為3 計算，柚皮苷為50 ng，黃芩苷為50 ng，靛玉紅為10 ng，白花前胡甲素為10 ng。

2.4 精密度試驗 精密配制含柚皮苷100 μg/mL、黃芩苷40 μg/mL，靛玉紅2 μg/mL，白花前胡甲素40 ng/mL 的對照品混合溶液，重復進樣6 次，以峰面積計算柚皮苷、黃芩苷、靛玉紅和白花前胡甲素的RSD 值分別為0.7%、0.3%、0.6%、1.0%。

2.5 重復性試驗 取廠家1 樣品制備5 份供試品溶液，在上述色譜條件下測定，結果柚皮苷、黃芩苷、靛玉紅和白花前胡甲素的RSD 分別為0.8%、1.2%、1.1%、1.8%。

2.6 穩定性試驗 取廠家1 樣品制備供試品溶液，置于室溫，分別于0、1、2、4、6、8、12、24 h在上述色譜條件下測定，結果柚皮苷、黃芩苷、靛玉紅和白花前胡甲素的RSD 分別為0.5%、0.3%、0.9%、1.6%，表明樣品中4 種成分在24 h 內穩定。

2.7 加樣回收率試驗 取廠家2 (批號20140204)寶咳靈顆粒9 份，每份0.50 g，按高、中、低3 種加入量分別精密加入“2.2.1”項下柚皮苷、黃芩苷、靛玉紅和白花前胡甲素對照品溶液適量，按“2.2.2”項下方法樣制備樣品溶液，分別測定，計算回收率，結果見表1。

2.8 樣品測定 分別取3 個不同廠家寶咳寧顆粒各3 份，按“2.2.2”項下方法制成供試品溶液，在上述色譜條件下進樣分析，按外標法計算藥物中4 種成分的量，結果見表2。- 表示未檢出

表1 加樣回收率測定結果Tab.1 Results of recovery tests

表2 樣品測定結果(n=3)Tab.2 Determination of samples (n=3)

3 討論

3.1 本實驗選用了不同比例的甲醇、乙醇進行比較，實驗結果顯示采用60%甲醇提取率較高，且樣品峰形良好，樣品成分提取較完全，故選擇60%甲醇作為提取溶劑。實驗中還比較了加熱回流、索氏提取及超聲提取4 種不同的提取方法，結果顯示當超聲提取45 min 時，所測4 種成分的量明顯優于索氏提取4 h，加熱回流最低，故采用超聲提取方法。

3.2 本實驗因同時測定的4 種成分具有不同的極性，采用固定比例的流動相難以一次分離完全，采用梯度洗脫，可在20 min 內同時檢出該4 種成分。流動相的選擇比較了甲醇-水、甲醇-0.05%H3PO4和乙腈-0.05% H3PO4等多種流動相的分離效果，結果顯示采用甲醇-水作為流動相時，各成分峰型較差，拖尾嚴重，而加入H3PO4后，峰型得到較大改善，且在梯度洗脫中，因采用甲醇作為流動相時，基線漂移較大，后改用乙腈得到改善。

3.3 不同廠家寶咳寧顆粒中4 種成分測定結果顯示，只有按照《中國藥典》規定檢測的黃芩苷含有量較接近，其余3 種成分的量有一定差異，因此在復方中成藥的質量控制中，建立多指標的質量控制方法有一定的必要性。

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