HPLC 法同時測定錦燈籠果實中5 種成分及等級鑒定

徐保利， 李先寬， 王 冰

(遼寧中醫藥大學，遼寧 大連116600)

錦燈籠為茄科植物酸漿Physalis alkekengi L.var. franchetii (Mast.)Makino 的干燥宿萼或帶果實的宿萼。秋季果實成熟、宿萼呈紅色或橙紅色時采收，干燥，具有解熱鎮痛、抗菌、強心、利尿及抗癌等作用［1］，其中黃酮類和酸漿苦素類成分在現在藥理研究中已被證明具有抗炎活性［2-3］。《中國藥典》2010 年版對錦燈籠藥材的質量規定為本品按干燥品計算，含木犀草苷不得少于0.10%［4］。

近些年對錦燈籠的化學成分及質量研究主要在錦燈籠的宿萼部分［5-7］，對其果實的研究較少［8］。中藥材化學成分復雜，目前對單一化學成分的測定并不能全面評價藥材質量，對多種成分的同時測定可以較全面的評價中藥質量［9-11］。因此本實驗利用高效液相色譜法對錦燈籠果實中的5 種成分進行了測定方法的研究，并對不同產地的錦燈籠果實進行了測定，同時對所得結果進行統計分析，為今后錦燈籠的藥材的應用，尤其是果實部位的應用和質量評價提供依據。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Agilent1100 HPLC (美國Agilent 公司);KQ3200B 型超聲清洗器(江蘇昆山)。

1.2 試劑 甲醇 (分析純，天津星月，批號20101126);甲醇 (HPLC 級，天津大茂，批號20101214);乙腈 (HPLC 級，天津大茂，批號20100326);磷酸(HPLC 級，天津科密歐，批號20100328);水為超純水。

1.3 對照品 木犀草苷(貴州迪大科技有限公司，批號20090928);木犀草素(中國食品藥品檢定研究院，批號111520-200504);酸漿苦素A、O由遼寧中醫藥大學許枬老師自制，酸漿苦素P 由遼寧中醫藥大學許亮老師自制，經歸一化法檢測純度均大于98%。

1.4 藥材 采集及購買于黑龍江、吉林、遼寧、山西、山東及安徽6 省共60 份，均經遼寧中醫藥大學藥用植物教研室王冰教授鑒定為茄科酸漿屬植物酸漿的果實。

2 方法與結果

2.1 對照品溶液的制備 分別精密稱取對照品木樨草苷3.25 mg，木犀草素2.50 mg，酸漿苦素A 3.00 mg，酸漿苦素P 2.50 mg 和酸漿苦素O 4.50 mg，置于25 mL 量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，配成質量濃度分別為130 、100、120 、100、180 μg/mL 的單一對照品貯備液。精密吸取上述對照品貯備液各1.0、1.0、1.0、1.0和5.0 mL，置10 mL 量瓶中，加甲醇稀釋至刻度搖勻，制成混合對照品溶液。

2.2 樣品制備 將干燥的錦燈籠果實粉碎成粉末過50 目篩，稱取1 g，精密稱定，置于50 mL 具塞錐形瓶中，加25 mL 甲醇，超聲1 h，濃縮定容至15 mL 量瓶中，備用。

2.3 色譜條件 Agilent TC-18 (4.6 mm×150 mm，5 μm);UV 檢測器;柱溫30 ℃;體積流量1.0 mL/min;檢測波長為350 nm (0 ～24 min)，220 nm (24 ～37 min);進樣量20 μL;流動相為0.2%磷酸 (A)-乙腈 (B)，梯度洗脫 (0 ～13 min，20%→23%B;13 ～37 min，23%→31%B)。色譜圖見圖1。

圖1 混合對照品(A)及供試品(B)HPLC 圖譜Fig.1 HPLC chromatograms of reference substances (A)and samples (B)

2.4 線性關系考察 分別將木犀草苷、木犀草素、酸漿苦素A、P 和O 用甲醇配置成一定濃度的對照品溶液，見表1。分別精密吸取4、8、12、16、20 μL按“2.2”項色譜條件檢測，記錄峰面積，以對照品量為橫坐標 (X)，峰面積為縱坐標(Y)，繪制標準曲線，回歸方程見表1。

表1 線性關系考察結果Tab.1 Calibration curve and linear range

2.5 精密度考察 精密量取木犀草苷、木犀草素、酸漿苦素A、P 和O 的混合對照品溶液20 μL，按“2.2”項下色譜條件重復進樣6 次，記錄峰面積，RSD 分別為0.9%、1.2%、0.8%、0.8%、1.1%。

2.6 重復性試驗 取干燥錦燈籠果實樣品1.0 g，共6 份，精密稱定，按“2.1”項下制備方法進行制備，按上述色譜條件進行HPLC 分析。根據所得5 種成分的峰面積計算其在樣品中的量。結果果實中木犀草苷、木犀草素、酸漿苦素A、P 和O 的RSD 值分別為1.3%、1.1%、1.0%、1.2% 和0.9%。試驗表明，該方法重復性良好。

2.7 穩定性試驗 取同一供試品溶液，分別在0、2、4、6、8、10 h 進樣20 μL，記錄峰面積，測得樣品中木犀草苷、木犀草素、酸漿苦素A、P 和O的RSD 值分別為1.1%、1.0%、1.3%、1.0%和1.3%。試驗表明，樣品中木犀草苷、木犀草素、酸漿苦素A、P 和O 在10 h 內穩定。

2.8 加樣回收率考察 稱取遼寧省鐵嶺市西豐縣尚文村柳河屯樣品1 g，精密稱定，平行6 份，每份分別精密加入木犀草苷1.40 μg/mL、木犀草素10 μg/mL、酸漿苦素A 50 μg/mL、酸漿苦素P 5 μg/mL、酸漿苦素O 18 μg/mL 各1 mL，按“2.1”項下制備方法進行制備，按“2.2”項下色譜條件進樣，分別測定，結果見表2。

表2 回收率試驗結果(n=6)Tab.2 Results of recovery tests (n=6)

2.9 統計分析 利用SPSS 18.0 軟件對所得數據進行K-均值聚類分析，K-均值聚類分析算法首先隨機從數據集中選取K 個點作為初始聚類中心，然后計算各個樣本到聚類中的距離，把樣本歸到離它最近的那個聚類中心所在的類。計算新形成的每一個聚類的數據對象的平均值來得到新的聚類中心，如果相鄰兩次的聚類中心沒有任何變化，說明樣本調整結束，聚類準則函數已經收斂。

2.10 結果 按照“2.1”項下對不同產地及來源地的錦燈籠果實進行制備，并按照“2.2”項下進行檢測，其結果見表3。

3 結論

3.1 在190 ～400 nm 波長范圍內，對木犀草苷、木犀草素、酸漿苦素A、P 和O 單獨對照液和混合對照液進行波長掃描，發現木犀草苷、木犀草素在220 nm 和350 nm 處有較好吸收，而酸漿苦素A、P 和O 在220 nm 處有較好吸收，但木犀草苷和木犀草素在220 nm 處的干擾峰較多，因此本研究采用切換波長的方法對錦燈籠藥材的5 種成分進行檢測。本研究采用了多種流動相，最終確定以0.2%磷酸水-乙腈為流動相，加入磷酸水使基線平穩，樣品峰與其他峰能達到基線分離。

3.2 錦燈籠果實中的木犀草素、酸漿苦素P 和O的量過低，在絕大多數樣品中無法檢測，因此在做方法學考察時，利用其對照品的混合溶液進行，并對錦燈籠果實樣品中的木犀草苷和酸漿苦素A 進行考察。

表3 不同產地錦燈籠果實化學成分測定及分級結果(μg/g)Tab.3 Results of chemical composition determination and classification for Physalis calyx seu Fructus from different growing areas (μg/g)

續表3

3.3 借鑒前期對錦燈籠宿萼有效成分測定的結果［12］，錦燈籠果實中木犀草苷、木犀草素、酸漿苦素A、O 和P 的量要遠遠低于錦燈籠宿萼中的量，而《中國藥典》2010 年版規定錦燈籠藥材為酸漿成熟的宿萼或帶果實的宿萼，由于其果實為漿果且富含糖類，易招蟲蛀，不宜干燥，因此不建議將錦燈籠的藥用部位定位為果實，僅保留宿萼部分。

3.4 錦燈籠果實在實際應用中并無分級標準，因此本實驗利用不同產地錦燈籠果實HPLC 檢測所得的結果對錦燈籠果實進行質量分級處理。因為錦燈籠果實中的木犀草素、酸漿苦素P 和O 含有量過低，在絕大多數樣品中無法檢測，所以將木犀草苷、酸漿苦素A 及木犀草苷、木犀草素、酸漿苦素A、P 和O 總量定為錦燈籠果實的分級標準，利用SPSS 18.0 統計軟件采用K-均值聚類分析方法，暫定為3 級，見表4 和表5。由表6 的方差分析結果可以看出木犀草苷、酸漿苦素A 及總量均達到了極顯著水平，因此三者均可作為錦燈籠果實分級標準的指標。以酸漿苦素A 作為分級指標，對所有樣品進行分級處理，結果見表3，以酸漿苦素A作為分級指標，其對于錦燈籠果實的專屬性更強，更能從藥材基源及質量方面反映錦燈籠果實的藥材質量。

表4 K-均值聚類分析的最終類中心值(μg/g)Tab.4 Final center value for K-means clustering analysis(μg/g)

表5 錦燈籠果實分級標準(μg/g)Tab.5 Physalis calyx seu Fructus classification standard(μg/g)

表6 錦燈籠果實分級指標的方差分析結果Tab.6 Results of index variance for the Physalis calyx seu Fructus grading

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