硫磺熏蒸對天麻有效成分的影響

靳燦燦， 李會軍

(中國藥科大學 天然藥物活性組分與藥效國家重點實驗室，江蘇 南京210009)

天麻為蘭科植物天麻Gastrodia elata Bl. 的干燥塊莖，具有息風止痙、平抑肝陽、祛風通絡之功效，用于小兒驚風，癲癇抽搐，破傷風，頭痛眩暈，手足不遂，肢體麻木，風濕痹痛［1］，為我國傳統(tǒng)名貴中藥。天麻中含有大量水分和多糖，不易干燥與儲存，因而在天麻的產地加工過程中，常用硫磺熏蒸藥材以達到干燥、漂白、殺菌防腐、改善外觀、易于儲存的目的［2］。雖然硫磺熏蒸對中藥材的加工儲藏起到了一定的積極作用，但現(xiàn)代研究表明硫熏中藥材會導致藥材性狀、化學成分、藥理作用等的改變［3-6］，以及二氧化硫及砷、汞等重金屬的殘留［7-8］，從而影響中藥的療效及安全性。已有文獻報道硫磺熏蒸會降低天麻中有效成分天麻素的量，導致SO2超標［9］，影響飲片湯劑的氣味、色澤、pH 等［10］，但目前硫熏對天麻中除天麻素外其他有效成分影響的報道較少。

本實驗以天麻中的主要活性成分天麻素、對羥基苯甲醇及4 個特征性成分巴利森苷、巴利森苷B、巴利森苷C、巴利森苷E (結構見圖1)為指標，建立了HPLC 法同時測定天麻中多個成分的定量分析方法。初步探討了硫熏加工對天麻中6 個主要酚類成分含有量變化的影響，為天麻產地加工提供參考依據(jù)。

1 儀器與材料

圖1 天麻中主要酚類成分的結構式Fig.1 Chemical structures of the main phenolic compounds in Gastrodiae Rhizoma

1.1 儀器 Agilent 1260 Series 高效液相色譜儀(美國Agilent 公司，包括G1311B 四元泵、G1329B自動進樣器、G4212B 二極管陣列檢測器、G1316A柱溫箱、Chemstation B 色譜工作站);HS3120 型超聲波提取器(500 W，100 kHz，昆山禾創(chuàng)超聲儀有限公司);Sartorius BT125D 電子天平(十萬分之一，德國Sartorius 公司);Sartorius BSA124S 電子天平(萬分之一，德國Sartorius 公司);MUL-9000 Series 超純水系統(tǒng)(美國Millipore 公司);數(shù)顯鼓風干燥箱GZX-9070 MBE (上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠)。

1.2 材料 乙腈(美國Tedia 公司)、甲醇(江蘇漢邦科技有限公司)為色譜純，水為去離子水，其余試劑均為分析純。

對照品天麻素(成都曼斯特生物科技有限公司，批號11122815)、對羥基苯甲醇(上海阿拉丁試劑公司，批號E1202004)、巴利森苷(上海純優(yōu)生物科技有限公司，批號131012)、巴利森苷B(批號13122013)、巴利森苷C (批號13122301)及巴利森苷E (批號14011606)購自成都普瑞法科技開發(fā)有限公司，以上對照品純度均大于98%。

10 批天麻藥材(S1 ～S10)采自云南昭通小草壩、湖北宜昌等種植地，經中國藥科大學李會軍教授鑒定為蘭科植物天麻Gastrodia elata Bl. 的干燥塊莖，憑證標本保存于中國藥科大學天然藥物活性組分與藥效國家重點實驗室。其中，S1、S3、S5、S7、S9 為烘干或曬干的未硫熏樣品，S2、S4、S6、S8、S10 為對應的硫熏加工的樣品。S1 ～S6 為產地農戶加工，S7 ～S10 為實驗室模擬產地加工。加工方法為:鮮天麻蒸或煮透(約10 ～20 min)后低溫烘干或曬干;或蒸、煮透，燃燒硫磺熏蒸數(shù)小時后曬干或烘干。樣品具體來源及加工方法見表1。

2 方法與結果

2.1 色譜條件及系統(tǒng)適用性 采用Agilent Zorbax SB-C18(4.6 mm × 50 mm，1.8 μm);以乙腈(A)-0.02% 磷酸 (B)為流動相，梯度洗脫(0 ～4 min，3% ～10% A;5 ～7 min，10% ～12%A;7 ～12 min，18% A;12 ～15 min，18% ～50%A);檢測波長220 nm;體積流量0.6 mL/min;柱溫30 ℃;進樣體積3 μL;理論塔板數(shù)以天麻素計算不低于3 000。色譜圖見圖2。

表1 樣品來源及加工方法Tab.1 Sources and processing method of samples

圖2 天麻HPLC 色譜圖Fig.2 HPLC chromatograms of Gastrodiae Rhizoma

2.2 對照品溶液的制備 精密稱取天麻素、對羥基苯甲醇、巴利森苷，巴利森苷B、巴利森苷C、巴利森苷E 對照品適量，置5 mL 量瓶中，加50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，制成質量濃度分別為0.316 5、0.099 5、0.648、0.261 8、0.110 2、0.407 0 mg/mL 的混合對照品溶液，存放于4 ℃冰箱中備用。

2.3 供試品溶液的制備 取未硫熏和硫熏天麻藥材粉末(過三號篩)各0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加50%甲醇25 mL，稱重，超聲提取30 min，放冷，用50%甲醇補足減失質量，搖勻，過0.22 μm 的微孔濾膜，取續(xù)濾液，即得。

2.4 方法學考察

2.4.1 標準曲線的繪制 分別精密量取“2.2”項下的混合對照品貯備液0.1、0.25、0.5、1.0、1.5、2.5 mL 置6 個5 mL 量瓶中，加50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，配制成一系列不同質量濃度的對照品溶液。以對照品貯備液作為標準曲線最大濃度。按“2.1”項下色譜條件，分別吸取以上7 個不同質量濃度的對照品溶液3 μL 注入高效液相色譜儀，記錄各化合物色譜峰峰面積。以質量濃度(μg/mL)為橫坐標(X)，峰面積為縱坐標(Y)，繪制標準曲線，計算得各化合物回歸方程 (見表2)。

表2 天麻中6 個酚類化合物的回歸方程、線性范圍、定量限及檢測限Tab.2 Calibration curves、linear range、LODs and LOQs of six phenolic components in Gastrodiae Rhizoma

2.4.2 精密度試驗 分別精密吸取上述配制好的 同一對照品溶液3 μL，連續(xù)進樣6 次，按上述色譜條件測定天麻素、對羥基苯甲醇、巴利森苷、巴利森苷B、巴利森苷C 及巴利森苷E 的峰面積，其RSD 值分別為 0.9%、0.4%、0.4%、0.3%、0.5%、0.4%，表明儀器精密度良好。

2.4.3 重復性試驗 取同一份樣品(S5)6 份，精密測定，按“2.3”項下方法分別制成供試品溶液，按上述色譜條件測定天麻素、對羥基苯甲醇、巴利森苷、巴利森苷B、巴利森苷C 及巴利森苷E 的峰面積，其RSD 值分別為1.5%、1.5%、0.8%、0.6%、2.1%、1.1%，結果表明本法重復性良好。

2.4.4 穩(wěn)定性試驗 取天麻藥材粉末(S5)，按“2.3”項下方法制成供試品溶液，在室溫下放置0、2、4、8、12、24 h 后進樣測定天麻素、對羥基苯甲醇、巴利森苷、巴利森苷B、巴利森苷C 及巴利森苷E 的峰面積，計算RSD 值分別為0.3%、0.3%、0.2%、0.2%、0.3%、0.3%，表明供試品溶液在24 h 內穩(wěn)定。

2.4.5 加樣回收率試驗 取已知含有量的同一批樣品(S5)9 份，每份0.25 g，精密稱定，置錐形瓶中，按低、中、高水平分別精密加入0.5、1.0、1.5 mL 的混合對照品溶液 (天麻素0.65 mg/mL、對羥基苯甲醇0.20 mg/mL、巴利森苷3.22 mg/mL、巴利森苷B1.36 mg/mL、巴利森苷C 0.35 mg/mL 及巴利森苷E1.43 mg/mL)，每個劑量平行3 份，按“2.3”項方法制備供試品溶液，按上述色譜條件檢測，計算各化合物加樣回收率。結果顯示各化合物加樣回收率均在95% ～105% 之間，且RSD 值＜ 3%，結果見表3。

2.5 樣品測定 取10 批天麻藥材，按“2.3”項下方法制備供試品溶液。精密吸取供試品溶液3 μL，注入色譜儀，記錄色譜峰峰面積，以外標法計算各樣品溶液中待測化合物的量，結果見表4。

3 討論

現(xiàn)代研究表明，天麻的主要活性成分是酚類化合物［11-12］，其中天麻素及其苷元對羥基苯甲醇具有鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜、抗驚厥及神經保護等作用［13-15］，常作為天麻藥材質量控制的指標成分。近幾年研究發(fā)現(xiàn)，除天麻素外，天麻素與檸檬酸縮合而成的酯類成分，如巴利森苷、巴利森苷B、巴利森苷C、巴利森苷E 的含有量亦較高［16-17］，可作為定量指標用于天麻質量評價。

表3 加樣回收率試驗結果(n=9)Tab.3 Results of recovery tests (n=9)

表4 樣品測定結果(n=3)Tab.4 Determination results of samples (n=3)

天麻為傳統(tǒng)習用硫磺熏蒸的中藥材之一，2011年國家食品藥品監(jiān)督管理局明確規(guī)定其二氧化硫殘留量不得超過400 mg/kg。本實驗結果顯示，與未硫熏樣品相比，硫磺熏蒸天麻后6 個酚類成分總量均有不同程度的降低，其中有效成分天麻素的量明顯下降，且S2、S4、S6、S8 硫熏樣品中天麻素量低于《中國藥典》天麻【含量測定】項下天麻素不得低于0.2%的限度規(guī)定。除S8 樣品中對羥基苯甲醇，S4 樣品中巴利森苷C 及S6 樣品中巴利森苷E 的量較其未硫熏樣品有增加外，其他硫熏組各成分的量均呈減少趨勢。推測原因可能是硫磺熏蒸天麻導致天麻素和巴利森苷發(fā)生水解作用，生成天麻苷元、巴利森苷C、巴利森苷E，由于硫磺用量、熏制時間及熏蒸次數(shù)的差異而導致對羥基苯甲醇、巴利森苷C 及E 的量出現(xiàn)不同程度增加。以上實驗表明硫磺熏蒸對天麻有效成分有一定的損失，建議在今后的產地加工過程中應嚴格控制硫熏天麻，避免過度硫熏影響藥效及用藥的安全性。硫磺熏蒸導致天麻化學成分變化的原因及機制、新化學成分的產生及對藥理作用的影響還有待進一步深入研究。

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