HPLC 法測定4 種細辛中馬兜鈴酸Ⅰ和細辛脂素

宋雙紅， 色林格， 陳 蓓， 崔浪軍， 商 澎*

(1. 西北工業大學生命學院，陜西 西安710072;2. 西北瀕危藥材資源開發國家工程實驗室，陜西師范大學生命科學學院，陜西西安710062)

細辛為馬兜鈴科植物北細辛Asarum heterotropoides Fr. Schmidt var. mandshuricum (Maxim.)Kitag.、漢城細辛Asarum sieboldii Miq. var. seoulense Nakai 或華細辛Asarum sieboldii Miq. 的干燥根及根莖［1］。前兩種習稱“遼細辛”。夏季果熟期或初秋采挖，除去地上部分和泥沙，陰干。細辛性溫味辛，具有祛風散寒、通竅止痛、止咳平喘、溫肺化陰等功效［2］。陜西省是細辛主產區，其原植物有4 種:華細辛Asarum sieboldii Miq.、銅錢細辛Asarum debile Franch.、毛 細 辛 Asarum himalaicum Hook. F. et Thoms 和雙葉細辛Asarum caulescens Maxim。由于目前中醫習慣使用的遼細辛及華細辛藥源短缺，以致民間有把毛細辛和銅錢細辛作為代用品使用的情況發生。2005 年版及以前《中國藥典》僅以揮發油作為細辛藥材質量控制指標。《中國藥典》2010 年版中增加了馬兜鈴酸Ⅰ限量測定及細辛脂素的測定。因此本實驗采用高效液相色譜法，對華細辛、毛細辛、銅錢細辛及遼細辛不同部位馬兜鈴酸Ⅰ和細辛脂素進行了測定和比較，為細辛藥材的合理用藥和質量控制提供參考。

1 儀器、試劑與材料

1.1 主要儀器 高效液相色譜儀(shimadzu LC-2010A)，超聲波清洗器(KQ-600DB)，液相色譜-質譜聯用儀(Agilent1100-Esquire 6000)，MILLI-Q超純水儀，電子天平等。

1.2 實驗試劑 對照品馬兜鈴酸Ⅰ (批號110746-200507)，細辛脂素(批號111889-201001)購自中國藥品生物制品檢定所，供含量測定用。乙腈、甲醇為色譜純，水為超純水。

1.3 實驗材料 藥材均采自陜西省寧強縣黃壩驛鎮，由陜西師范大學生命科學學院植物分類研究室田先華教授鑒定，分別為馬兜鈴科植物華細辛Asarum sieboldii Miq.、銅錢細辛Asarum debile Franch.、毛細辛Asarum himalaicum Hook. F. et Thoms 和遼細辛Asarum heterotropoides Fr. Schmidt var. mandshuricum (Maxim.)Kitag. 的干燥全草。樣品保存于陜西師范大學植物標本室。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 MERCK C18色譜柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm);體積流量1.0 mL/min;柱溫30 ℃;進樣量10 uL;檢測波長260 nm;以乙腈(A)-0.05% 磷酸水 (B)為流動相，梯度洗脫(0 ～20 min，30%→45%A;20 ～30 min，45%A;30 ～35 min，45% →55% A;35 ～45 min，55% →75%A)，對照品及樣品色譜圖見圖1。

圖1 對照品(A)及細辛樣品(B)HPLC 圖譜Fig.1 HPLC chromatograms of reference substances (A)and sample (B)

2.2 對照品溶液的制備 精密稱定馬兜鈴酸Ⅰ對照品2.34 mg，細辛脂素對照品1.95 mg，分別置于10 mL 量瓶中，用甲醇溶解并定容，超聲處理5 min使樣品溶解，待冷卻后得對照品貯備液。

2.3 樣品溶液的制備 精密稱定60 ℃干燥至恒重的細辛樣品粉末0.63 g (過100 目篩)，置于25 mL錐形瓶中，精確加入70%甲醇15 mL，稱定質量，密封，超聲(500 W，40 kHz)處理45 min，取出并冷卻至室溫，稱定并補足損失的質量。進樣前搖勻，用0.22 μm 濾膜過濾后作為供試品溶液。

2.4 線性關系考察 取“2.2”項制備的馬兜鈴酸Ⅰ貯備液，精確稀釋至0.01、0.1、1、10、60、110、160、250 μg/mL，分別進樣10 μL，以進樣質量濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標繪制標準曲線，得回歸方程為Y = 1 × 106X - 322.25 (r =0.999 7)，結果表明馬兜鈴酸Ⅰ在0.01 ～250 μg/mL之間與峰面積呈良好的線性關系。

同樣取細辛脂素貯備液，稀釋至0.6、6、60、90、120、150、200 μg/mL，分別進樣10 μL，以進樣質量濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標繪制標準曲線，得回歸方程為Y =1 ×106X -9 342.4 (r =0.999 7)，結果表明細辛脂素在0.6 ～200 μg/mL之間與峰面積呈良好的線性關系。

2.5 精密度試驗 分別取馬兜鈴酸Ⅰ和細辛脂素對照品溶液，照“2.1”項色譜條件重復進樣5次，每次10 μL，測得馬兜鈴酸Ⅰ和細辛脂素峰面積積分值的RSD 分別為2.5%和0.9%，表明儀器的精密度良好。

2.6 重復性試驗 取同一份細辛樣品按“2.3”項方法制備5 份樣品，連續進樣，每次10 μL，測馬兜鈴酸Ⅰ和細辛脂素的峰面積積分值的RSD 分別為0.5%和0.6%，表明重復性良好。

2.7 穩定性考察 取同一份供試品溶液，分別于配制后0、2、4、10 h 進樣，測定馬兜鈴酸Ⅰ峰面積RSD 為2.6%，細辛脂素峰面積RSD 為0.8%，表明樣品中馬兜鈴酸Ⅰ和細辛脂素在10 h 內穩定，可以滿足本方法測定時間上的要求。

2.8 加樣回收率試驗 精密稱定已知含有量華細辛根作為實驗樣品，分別準確加入對照品(馬兜鈴酸Ⅰ160 μg/mL，細辛脂素120 μg/mL)0.25，0.5 及1.0 mL，按“2.3”項方法制作供試品，依“2.1”項色譜條件進行測定，分別計算馬兜鈴酸Ⅰ (表1)和細辛脂素 (表2)的加樣回收率［15］。

表1 馬兜鈴酸Ⅰ加樣回收率實驗結果Tab.1 Results of recovery tests for aristolochic acid Ⅰ

表2 細辛脂素加樣回收率實驗結果Tab.2 Results of recovery tests for asarinin

2.9 樣品測定 分別取4 種細辛不同部位樣品，按“2.3”項樣品制備方法操作，得各供試品溶液，按“2.1”項色譜方法測定，以外標法計算馬兜鈴酸Ⅰ和細辛脂素量，結果見表3。

表3 樣品測定結果(n=3)Tab.3 Content of aristolochic acid Ⅰand asarinin in different samples (n=3)

3 質譜鑒定

樣品中馬兜鈴酸Ⅰ和細辛酯素的量都比較低，本實驗在采用對照品驗證的基礎上，又通過液相色譜-質譜聯用技術，對兩個標準化合物的相對分子質量進行了驗證，以確保結果的準確性。

3.1 質譜條件 ESI 離子源，霧化氣壓為35 psi(1 psi =6.895 kPa)，干燥氣流量為11 mL/min，干燥溫度為350 ℃，質譜掃描質量范圍為50 ～500。采用全掃描一級質譜和選擇離子掃描二級質譜兩種方式同時測定。色譜條件同“2.1”項。

3.2 質譜檢測結果 馬兜鈴酸Ⅰ(相對分子質量341.27，結構式見圖2，質譜圖見圖3) ［M-H］-離子m/z 340，碎片離子m/z 分別為340、324、293;細辛脂素(相對分子質量354.35，結構式見圖4，質譜圖見圖5)［M-H］-離子m/z 353，碎片離子m/z 分別為353、339、310。

圖2 馬兜鈴酸Ⅰ結構式Fig.2 Structure of aristolochic acid Ⅰ

4 討論

圖3 馬兜鈴酸Ⅰ質譜圖Fig.3 MS chromatogram of aristolochic acid Ⅰ

圖4 細辛脂素結構式Fig.4 Structure of asarinin

圖5 細辛脂素質譜圖Fig.5 MS chromatogram of asarinin

4.1 馬兜鈴酸又名增噬力酸或木通甲素，在馬兜鈴屬植物中普遍存在并且在個別的幾種中含有量較大。近年來，國內外發現并報道了不少因服用過量含馬兜鈴酸的中草藥而導致腎衰竭的病例，引起國內外的廣泛關注［3］。《中國藥典》2005 年版起，已不再收錄廣防己、關木通、青木香等含有馬兜鈴酸的中藥方，并使用其他品種替代。此外，對其他含馬兜鈴酸生藥的藥用部位也進行了更改。如《中國藥典》2000 年版以前細辛的藥用部位均為“全草”，但后來考慮到細辛地上部分馬兜鈴酸含有量較高，且古代中醫一直僅使用根部， 《日本藥局方》也僅用“根和根莖”，所以《中國藥典》2005年起將藥用部位修訂為根和根莖。 《中國藥典》2010 年版進一步對細辛中馬兜鈴酸Ⅰ進行限量測定［1］。多年來對于細辛中是否含有馬兜鈴酸Ⅰ，馬兜鈴酸Ⅰ含有量多少及其腎毒性的文獻報道不一，有文獻報道細辛藥材中不含有馬兜鈴酸Ⅰ［4］，也有文獻報道馬兜鈴酸在華細辛、北細辛、單葉細辛中含有量甚微，只有關木通、廣防己、青木香所含馬兜鈴酸的0.15% ～4.8%［5］。因此需要對不同種細辛中馬兜鈴酸進行定量測定，為安全用藥提供參考。

4.2 細辛脂素也廣泛存在于馬兜鈴科的植物中，是細辛中的非揮發性成分，具有抗病毒和抗結核桿菌的作用［6］。有文獻報道細辛脂素對免疫有抑制性作用，能夠產生保護受體器官的作用［7］。近年來對細辛中細辛脂素的定量測定鮮有報道。《中國藥典》2010 年版將細辛脂素作為細辛藥材的質量控制指標之一。因此有必要建立并測定細辛中細辛脂素的量，為細辛藥材質量控制和開發利用提供科學依據。

4.3 本實驗提取溶劑及提取方法的選擇以華細辛為研究對象，分別比較了甲醇、70%甲醇和乙醇為提取溶劑，超聲和熱回流的提取效果。結果4 種溶劑的提取率無顯著差異，超聲提取的效果優于回流提取，且快速省時，故采用70%甲醇為溶劑，超聲提取45 min。

4.4 色譜條件的選擇和優化參照文獻［8］，比較了流動相甲醇-磷酸水、乙腈-磷酸水系統，結果乙腈-磷酸水分離效果較佳，故采用乙腈-磷酸水系統為流動相。細辛脂素在287 nm 波長下吸光值較高，但在260 nm 波長下馬兜鈴酸和細辛脂素均具有較高靈敏度［9］，因此檢測波長選用260 nm。該法可以同時檢測兩種待測成分，且達到基線分離，符合定量測定的要求［10］。

4.5 《中國藥典》2010 年版對馬兜鈴酸Ⅰ進行了限量，依高效液相色譜法測定，按干燥品計算，馬兜鈴酸Ⅰ的含有量不得過0.001%。而細辛脂素作為細辛的指標成分之一，按干燥品計算，含細辛脂素不得少于0.050%［1］。本實驗檢測結果，根和莖中馬兜鈴酸Ⅰ的量都低于《中國藥典》2010 年版規定標準，葉中含有量較高，故以根及根莖入藥是比較安全的。細辛脂素在華細辛和遼細辛根、莖、葉中均檢測到，但在毛細辛中未檢測出，銅錢細辛除莖外，也未測出細辛脂素。可見不同種細辛中馬兜鈴酸Ⅰ和細辛脂素的量差別較大，且同一種細辛地上部分和地下部分馬兜鈴酸Ⅰ的量亦有較大差別，提示用藥上應合理取材。有文獻分析比較同一產地華細辛、毛細辛和銅錢細辛的揮發性成分。結果3 種細辛揮發性成分在數量和含有量上各有差異，此外3 種細辛均含有獨特的揮發性成分［11-13］。全面評價藥材質量需綜合多種揮發性成分及非揮發性成分［14］。從臨床用藥安全考慮，建議廠家應對細辛藥材進行用藥部位篩選和馬兜鈴酸的限量檢查，既要保證藥效，又要保證毒性成分的用量在允許范圍內。

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