瓜蔞皮注射液干預急性心肌梗死的機制研究

趙啟韜， 黃臻輝， 琚 姝， 張永清*

(1. 山東中醫(yī)藥大學中藥學博士后流動站，山東 濟南250355;2. 上海第一生化藥業(yè)有限公司藥物研究所，上海200336)

急性心肌缺血是導致心臟病患者心肌梗死、心絞痛的直接原因，也是患者主要的死亡原因［1-2］。瓜蔞皮注射液是最早上市的中成藥之一，多年臨床實踐證明，該藥治療冠心病痰濁壅塞證療效顯著［3-4］，但該藥系統(tǒng)、規(guī)范地藥效評估及作用機制研究一直欠缺。在前期研究中，利用結扎冠狀動脈制造急性心肌缺血大鼠模型，采用目前權威的心肌缺血診斷指標，如心電圖ST 段變化值、心肌梗死面積、心肌梗死率、血漿5 項心肌酶活性等，系統(tǒng)評估了瓜蔞皮注射液對急性心肌缺血的干預效果。結果顯示該藥對急性實驗性心肌缺血保護作用顯著(研究數據另行整理投稿)。本研究通過檢測瓜蔞皮注射液對急性心肌缺血大鼠體內ET/NO、TXB2/6-kete-PGF1a、SOD/MDA 平衡的影響，探究該注射液對心肌缺血動物的血管擴張程度、血液凝集狀態(tài)，以及心肌組織氧化應激狀態(tài)的調節(jié)作用，旨在明確瓜蔞皮注射液發(fā)揮藥效的途徑，為最終探明瓜蔞干預冠心病的機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 動物 Wistar 大鼠，體質量220 ～300 g，雄性，由山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司提供。

1.2 試劑 瓜蔞皮注射液 (上海第一生化制藥廠，4 g/mL);丹參注射液(廣州白云山和記黃埔中藥有限公司，批號A1A031，3 g/mL);內皮素(ET)、一氧化氮(NO)、內皮型一氧化氮合酶 (eNOS)、6-酮-前列環(huán)素(6-Keto-PGF1a)、血栓素B2(TXB2)、脂質過氧化物 (丙二醛，MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)7 種試劑盒(中生北控生物科技股份有限公司，批號20000271，以及南京建成生物科技公司)。

1.3 動物分組及處理 50 只大鼠隨機分為對照、模型、丹參注射液、瓜蔞注射液大、小劑量5 個組，每組10 只。大鼠自由飲食飲水。腹腔注射給藥，連續(xù)給藥7 d。其中瓜蔞大劑量組給予瓜蔞注射液4 mL/(kg·d)，瓜蔞小劑量組給予瓜蔞注射液2 mL/(kg·d)。丹參組給予丹參注射液為3 mL/(kg·d)，模型組及正常對照組給予等容積生理鹽水。于末次給藥后30 min 實施左冠狀動脈結扎手術，對照組實行假手術。手術具體操作參考文獻［5］。手術6 h 后，測心電圖，腹腔靜脈取血，取心臟。以備檢測各種指標。

1.4 NO 及eNOS 酶活性等的檢測 4 ℃，3 000 r/min 離心15 min 分離血漿。按試劑盒說明書要求分別測定各組大鼠血漿及心肌組織中的ET、NO、6-Keto-PGF1a、TXB2、MDA水平，以及eNOS、SOD 的酶活性。

1.5 數據處理統(tǒng)計學處理采用SPSS 11.0 統(tǒng)計軟件包進行統(tǒng)計分析，數據以“均數±標準差”表示，多組均數用F檢驗，組間兩兩比較用Q 檢驗。

2 結果

2.1 內皮素、一氧化氮及一氧化氮合酶活性 如表1 所示，與對照組相比，急性心肌缺血模型大鼠血漿中ET 水平顯著升高(P ＜0.01)，NO 水平顯著下降(P ＜0.01);瓜蔞注射液大、小劑量組大鼠血漿中ET、NO 水平異常變化程度較輕，與丹參注射液組相比無明顯差異(P ＜0.05或P ＜0.01，表1)。進一步檢測了各組大鼠血漿eNOS 的活性，發(fā)現(xiàn)模型組大鼠血漿eNOS 活性相比對照組顯著低下;而瓜蔞注射液大、小劑量組大鼠血液eNOS 活性均明顯高于模型組，與丹參注射液組差別不明顯(P ＜0.05，表1)。

表1 各組大鼠血漿ET、NO 及eNOS 水平(±s，n=10)

表1 各組大鼠血漿ET、NO 及eNOS 水平(±s，n=10)

注:與對照組比較，△P ＜0.05，△△P ＜0.01;與模型組比較，* P ＜0.05，＊＊P ＜0. 01;與丹參組比較，#P ＜0.05

組別ET/(μmol·L -1)NO/(μmol·L -1)eNOS/(μmol·L -1)77.337±14.049 26.750±5.007 4.86±1.217模型組 116.54±22.221△△ 18.889±6.333△△ 4.011±0.784△丹參組 77.018±14.049＊＊ 27.556±5.548＊＊ 4.403±1.032*瓜蔞小劑量組 102.41±18.608* 30.667±6.083＊＊# 4.155±0.303*瓜蔞大劑量組 99.128±24.158* 25.333±3.162＊＊ 4.133±0.746對照組*

2.2 血栓素及6 酮前列環(huán)素的水平 檢測結果見表2，和對照組相比，模型組大鼠血漿TXB2水平顯著升高，而6-Keto-PGF1a 明顯下降(P ＜0.01)。丹參注射液組、瓜蔞注射液大、小劑量組大鼠血漿TXB2、6-Keto-PGF1a 水平均接近正常組，而與模型組差異顯著(P ＜0.01)。其中瓜蔞注射液大劑量對心肌缺血大鼠血液中2 種指標的變化有更顯著的影響，對6-Keto-PGF1a 水平的影響效果明顯優(yōu)于丹參注射液(P ＜0.05，表2)。

表2 各組大鼠血漿TXB2 及6-Keto-PGF1a 水平(±s，n=10)

表2 各組大鼠血漿TXB2 及6-Keto-PGF1a 水平(±s，n=10)

注:與對照組比較，△P ＜0.05;△△P ＜0.01;與模型組比較，* P ＜0.05，＊＊P ＜0.01;與丹參組比較，# P ＜0.05

組別 TXB2/ (pg·mL -1)6-Keto-PGF1a/ (pg·mL -1)208.62 ±38.52 374.87 ±83.06模型組 320.83 ±79.5△△ 241.27 ±98.26△△丹參組 224.66 ±30.72＊＊ 371.71 ±62.41＊＊瓜蔞小劑量組 228.74 ±42.37＊＊ 255.41 ±53.0＊＊瓜蔞大劑量組 249.29 ±47.54＊＊ 435.98 ±66.89對照組＊＊

2.3 丙二醛水平及超氧化物歧化酶活性 試劑盒檢測結果見表3。與假手術組相比，模型組大鼠心肌組織MDA 水平明顯上升，而SOD 活性極大減弱(P ＜0.01)。丹參注射液組、瓜蔞注射液均可顯著逆轉MDA、SOD 的這種變化，使之接近正常組(P ＜0.01)。其中瓜蔞皮注射液的效果優(yōu)于丹參注射液。該注射液對MDA、SOD 的調節(jié)作用與劑量有關，大劑量的作用效果更為顯著(P ＜0.01，表3)。

表3 各組大鼠血漿中MDA 及SOD (±s，n=10)

表3 各組大鼠血漿中MDA 及SOD (±s，n=10)

注:與對照組比較，△P ＜0.05，△△P ＜0.01;與模型組比較，* P ＜0.05，＊＊P ＜0. 01;與丹參組比較，# P ＜0.05

組別 MDA/ (nmol·mL -1) SOD/ (U·L -1)5.62 ±0.52 90.54 ±8.06模型組 7.83 ±0.85△△ 29.91 ±5.53△△丹參組 6.66 ±0.72* 55.71 ±7.56＊＊瓜蔞小劑量組 5.84 ±0.67＊＊ 51.41 ±7.43＊＊瓜蔞大劑量組 5.09 ±0.54＊＊ 79.73 ±8.89對照組＊＊

3 討論

瓜蔞皮及其成藥瓜蔞皮注射液是中醫(yī)最常用的祛痰散結藥，和大量其他中藥相同，該藥也存在使用歷史悠久、臨床療效顯著，但作用機制不明的問題。本研究結果顯示，對急性心肌缺血大鼠，瓜蔞皮注射液可顯著提高其血漿eNOS 酶活性、NO 水平、6-Keto-PGF1a 水平，以及心肌組織SOD 活性;顯著降低其血漿ET 水平、TXB2水平，及心肌組織MDA 水平。

急性心肌缺血最早期的主要病理環(huán)節(jié)之一是心肌細胞、血管內皮細胞中eNOS 表達量及酶活性顯著降低，NO 的合成減少，而ET 分泌量反而增加［6-8］。體內NO/ET 比值失衡，加劇了血管緊張的程度，降低冠脈流量，進一步促發(fā)了炎癥反應及心肌壞死［8］。同時缺血缺氧使體內血小板迅速被激活并聚集，釋放出大量的腺苷二磷酸、血栓素A(TXA，TXB2的前體)。動物血漿中TXB2顯著增加，而6-Keto-PGF1a 水平降低，TXB2/6-Keto-PGF1a 的比值升高，血栓形成的危險性急速增大［9-10］。心肌缺血及其隨后的再灌注，導致心肌組織內產生大量的自由基(ROS)，氧化應激急劇增加。ROS 可激活核因子NFκB，促進炎癥相關蛋白的表達，并可直接破壞細胞膜雙分子層及DNA 等大分子的結構，隨后造成心肌細胞凋亡、心臟功能喪失［11-14］。本研究通過系列檢測證實，瓜蔞皮注射液對急性心肌缺血引起的上述3 種主要病理途徑均有干預作用。該藥至少通過以下3 種途徑發(fā)揮對急性心肌缺血的保護作用:①抑制ET的合成、激活eNOS 活性，提高NO 分泌量，增強冠狀動脈的擴張，增加冠脈流量;②降低血栓素/前列環(huán)素的比值，調節(jié)血液凝集狀態(tài)，抑制血栓形成;③提高心肌組織SOD活性，阻止脂質過氧化，逆轉過度氧化應激狀態(tài)。因此，對缺血心肌的保護作用是多途徑、多靶點的。該注射液可能含有多種保護心肌缺血的活性成分，不同成分作用機制不同。

本研究還發(fā)現(xiàn)，瓜蔞皮注射液的上述作用效果并不平均，對心肌缺血大鼠體內6-Keto-PGF1a 水平、SOD 活性的影響更為顯著。由此推測，瓜蔞皮注射液可能對急性心肌缺血動物體內6-Keto-PGF1a、SOD 水平具有更強的調控作用。擬在今后研究中，對該藥的上述作用進行更深層次的探究，為最終探明瓜蔞皮干預冠心病的作用機制奠定基礎。

［1］ Kloner R A. Natural and unnatural triggers of myocardial infarction［J］. Prog Cardiovasc Dis，2006，48(4):285-300.

［2］ Misra M K，Sarwat M，Bhakuni P，et al. Oxidative stress and ischemic myocardial syndromes［J］. Med Sci Monit，2009，15(10):209-219.

［3］ 鄭文祥. 瓜蔞皮注射液治療心絞痛的臨床觀察［J］. 臨床誤診誤治，2008，21(1):37-38.

［4］ 唐 明. 瓜蔞皮注射液對冠心病心絞痛治療的臨床觀察［J］. 內蒙古中醫(yī)藥，2011，31(24):4-5.

［5］ 趙啟韜，孟冰雪，黃臻輝，等. 不同品系栝樓果皮抗心肌梗塞藥效學比較研究［J］. 藥物評價研究，2013，36(2):95-99.

［6］ Stow L R，Jacobs M E，Wingo C S，et al. Endothelin-1 generegulation［J］. FASEB，2011，25(1):16-28.

［7］ Paine N J，Bosch J A，Van Zanten J J. Inflammation and vascular responses to acute mental stress:implications for the triggering of myocardial infarction. Curr Pharm Des，2012，18(11):1494-1501.

［8］ Oikonomidis D L，Baltogiannis G G，Kolettis T M. Do endothelin receptor antagonists have an antiarrhythmic potential during acute myocardial infarction?Evidence from experimental studies［J］. J Interv Card Electrophysiol. 2010，28 (3):157-165.

［9］ Li J，Zhang H，Zhang C. Role of inflammation in the regulation of coronary blood flow in ischemia and reperfusion:mechanisms and therapeutic implications［J］. J Mol Cell Cardiol.2012，52(4):865-872.

［10］ Reiss A B，Edelman S D. Recent insights into the role of prostanoids in atherosclerotic vascular disease［J］. Curr Vasc Pharmacol. 2006，4(4):395-408.

［11］ Li Z L，Hu J，Li Y L，et al. The effect of hyperoside on the functional recovery of the ischemic/reperfused isolated rat heart:potential involvement of the extracellular signal-regulated kinase 1/2 signaling pathway［J］. Free Radic Biol Med. 2013，57:132-140.

［12］ Venardos K M，Perkins A，Headrick J，et al. Myocardial ischemia-reperfusion injury，antioxidant enzyme systems，and selenium:a review［J］. Curr Med Chem，2007，14(14):1539-1549.

［13］ Morita K. Surgical reoxygenation injury of the myocardium in cyanotic patients:clinical relevance and therapeutic strategies by normoxic management during cardiopulmonary bypass［J］.Gen Thorac Cardiovasc Surg，2012，60(9):549-556.

［14］ Yuhki K，Kojima F，Kashiwagi H，et al. Roles of prostanoids in the pathogenesis of cardiovascular diseases:Novel insights from knockout mouse studies［J］. Pharmacol Ther，2011，129(2):195-205.