Box-Behnken 設計-效應面法優化水紅花子中總黃酮和花旗松素的提取工藝

佟苗苗， 初 明， 王添敏， 李 娜， 張 慧， 王月丹， 翟延君*

(1. 遼寧中醫藥大學藥學院，遼寧 大連116600;2. 北京大學醫學部基礎醫學院，北京100191)

水紅花子為蓼科植物紅蓼Polygonum orientale L. 的干燥成熟果實，始載于《中國藥典》1977 年版，具有散血消癥、消積止痛、利水消腫的功效，用于癥瘕痞塊、癭瘤腫痛、食積不消、胃脘脹痛等癥［1］。水紅花子主要含有花旗松素、槲皮素、山柰酚等黃酮類成分，本課題組在實驗研究中發現，總黃酮有較好的抗腫瘤作用，且黃酮中以花旗松素含有量較高。藥理研究表明，花旗松素有降血壓，保護缺血、缺氧對腦組織的損傷的功效，以及抗炎、抗病毒、抗輻射、抗突變、抗腫瘤等作用［2-4］。因此本實驗以水紅花子總黃酮、花旗松素提取率的總評歸一值為指標［5］，采用Box-Behnken 設計實驗，優選出最佳的提取條件，為水紅花子的開發利用提供理論參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器與試劑 Agilent 1260 Infinity 高效液相色譜儀，DAD 檢測器(美國Agilent 公司)。島津UV1750 紫外可見分光光度計(日本島津公司)，電子天平(上海天平儀器廠)。花旗松素對照品(純度98%，百靈威化學技術有限公司)。乙腈為色譜純，水為重蒸水，其他皆為分析純。

1.2 材料 水紅花子Polygoni Orientalis Fructus 購于河北安國藥材市場，經本校中藥鑒定教研室翟延君教授鑒定為蓼科植物紅蓼Polygonum Orientale L. 干燥成熟果實。

2 方法與結果

2.1 水紅花子總黃酮的測定

2.1.1 對照品溶液的制備 精密稱取花旗松素對照品適量，加65%乙醇制成質量濃度為24 μg/mL 的對照品溶液R1 (供測定總黃酮用)，加甲醇制成質量濃度為71 μg/mL的對照品溶液R2 (供HPLC 用)。

2.1.2 供試品溶液的制備 精確稱取水紅花子藥材粉末5.0 g，置250 mL 圓底燒瓶中，加65%乙醇100 mL 加熱回流60 min，過濾，定容于100 mL 量瓶中。

2.1.3 波長的選擇 將供試品溶液和對照品溶液分別進行光譜掃描。結果兩者在290 nm 附近有一最大吸收峰，故選擇檢測波長為290 nm。

2.1.4 標準曲線的繪制 精密吸取R1 對照品溶液2.00、3.75、5.00、7.50、10.00 mL 稀釋至10 mL 量瓶中，在290 nm 處測定其吸光值。以吸光度為縱坐標，質量濃度為橫坐標，繪制標準曲線，得回歸方程為Y = 0.036X -0.020，r=0.998 9。表明花旗松素在4.80 ～24.00 μg/mL范圍內與吸光度呈良好的線性關系。

2.1.5 水紅花子總黃酮的測定［6-7］精密吸取供試品溶液0.5 mL，定容于50 mL 量瓶中，按照“2.1.4”項的操作，在290 nm 處測定吸收值，代入標準曲線并計算出供試品中總黃酮的量。

2.2 花旗松素的測定

2.2.1 色譜條件 Agilent 色譜柱 (4.6 mm × 150 mm，5 μm)，流動相為乙腈(A)-水(B)溶液梯度洗脫(0 ～5 min，5% ～10% A;5 ～10 min，10% ～18% A;10 ～18 min，18% ～28%A;18 ～24 min，28% ～30% A;24 ～34 min)，柱溫25 ℃，檢測波長290 nm，體積流量1.0 mL/min。

2.2.2 標準曲線的繪制 精密吸取花旗松素對照品溶液(R2)2、4、6、8、10、12 μL 依次注入色譜儀中，測定峰面積。以進樣質量為橫坐標，峰面積值為縱坐標，進行線性回歸，得回歸方程Y =4 084.5X +48.1，r =0.999 8。表明花旗松素進樣量在0.142 ～0.852 μg 范圍內，峰面積與進樣量呈良好的線性關系。

2.2.3 花旗松素含有量的測定 精密吸取供試品溶液5 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，見圖1。按外標法以峰面積計算花旗松素含有量。

圖1 花旗松素對照品(A)和水紅花子(B)的HPLC 圖譜

2.3 星點設計實驗

2.3.1 模型擬合 提取因素為提取溶劑乙酸體積分積、提取時間和液料比，因提取次數為非連續變量，不能進行回歸處理，提取1 次，分析因素見表1，設計方案及試驗結果見表2。

表1 因素與水平

由回歸分析表結果可知，乙醇體積分數和液料比對得率有顯著影響，回歸方程失擬性檢驗P =0.330 3 ＞0.05，差異不顯著;總回歸方程P ＜0.01，達非常顯著水平，說明該方程與實際情況擬合很好，可利用該模型分析預測最佳提取工藝條件，見表3。

表2 Box-Behnken 試驗設計與結果

表3 回歸分析結果

2.4 驗證試驗結果 由簡化后的二項式模型進行預測分析，最優工藝為:采用20 倍量66%的乙醇提取1 次，時間為93 min。按最優工藝進行驗證，結果見表4。表4 可知，模型是比較可靠的，證明用效應面法來優化水紅花子總黃酮和花旗松素工藝是可行的。

表4 預測值與實際值的比較

3 討論

3.1 已報道的水紅花子總黃酮測定的文獻中，多以蘆丁為對照品［8-9］，但蘆丁不是水紅花子的異性成分，不能很好地反映藥材內在質量［10］。水紅花子中含有量較高的花旗松素的最大吸收波長為290 nm，供試品溶液的最大吸收波長為286 nm和318 nm，因此選擇最為接近的290 nm 作為測定波長。

3.2 采用紫外分光光度法對水紅花子中總黃酮進行測定，方法簡便經濟、快速、準確可靠，可以用于檢測藥材中的總黃酮。采用HPLC 法測定其主要成分花旗松素，該方法具靈敏、穩定、專屬性強等優點。

3.3 水紅花子總黃酮和花旗松素都是該藥材的活性成分且含有量相對較高。采用總評“歸一值”法將水紅花子醇提工藝中的兩指標綜合起來，并成功建立數學模型進行優化與預測分析。由于響應面優化法采用非線性數學模型擬合，在中心點進行重復性實驗以提高實驗的精確度，預測值更接近真實值。試驗表明，最佳工藝簡單、穩定，可行。

［1］ 國家藥典委員會. 中華人民共和國藥典:2010 年版一部［S］. 北京:中國醫藥科技出版社，2010.

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