回流法提取銀杏葉總黃酮的研究

李新舟，張懷宇，許友玲

（福建師范大學閩南科技學院生命科學與化學系，福建 泉州362332）

銀杏體內含有許多生物活性物質，可以抵御昆蟲、細菌和真菌的侵入，銀杏葉在中國作為傳統的中草藥已經有幾千年的歷史，受到國內外醫學界的高度重視［1］。

早在20世紀60年代初，干銀杏葉的丙酮－水（60∶40）提取物被用于治療腦部供血不足，取得了非常顯著的療效且沒有明顯的副作用［2］。此后，其它國家相繼致力于銀杏制品的開發。現代科學研究證明，銀杏葉含有200多種藥用成分，其中黃酮和萜內酯是銀杏葉中兩類重要的生理活性物質，具有捕獲自由基，抑制血小板活化因子，預防和治療心、腦血管疾病、老年癡呆，擴張血管、降低血脂、抗衰老等藥理作用［3－4］。進一步研究表明，銀杏葉提取物還具有較強的抗腫瘤、抗寄生生物、抗病毒活性［5］。

近年來，銀杏葉制劑與銀杏葉粗提取物越來越多地用于保健食品及飲品。作者用乙醇回流法提取銀杏葉總黃酮，考察料液比（g∶mL，下同）、乙醇體積分數、提取時間、提取溫度等因素對銀杏葉總黃酮提取率的影響，通過正交實驗優化了銀杏葉總黃酮提取工藝，并進一步研究了微波輔助對銀杏葉總黃酮提取的影響。

1 實驗

1.1 材料與試劑

銀杏葉，山東臨沂郯城。

槲皮素對照品；無水乙醇（AR），石油醚，5%亞硝酸鈉，4%氫氧化鈉，10%硝酸鋁，4%鹽酸，蒸餾水。

1.2 方法

1.2.1 銀杏葉粉末的制備

將銀杏葉清洗干凈后于70℃烘干5～6h，然后用高速多功能粉碎機粉碎，過40目篩。取適量的銀杏葉粉末用石油醚于50℃回流提取，去脂除雜，過濾，將濾渣風干，備用。

1.2.2 標準曲線的繪制

準確稱取10mg槲皮素對照品，配制成0.1mg·mL－1的槲皮素標準溶液作為對照溶液。精密量取對照溶液0.5mL、1.0mL、1.5mL、2.0mL、2.5mL、3.0mL分別置于50mL容量瓶中，加30%乙醇至10 mL，加0.5mL 5%亞硝酸鈉溶液，搖勻，靜置5min后加0.5mL 10%硝酸鋁溶液，搖勻，靜置6min后加10 mL 4%氫氧化鈉溶液，用30%乙醇定容至刻度，搖勻，靜置5～10min后測定吸光度，平行測定3次，以吸光度（A）為橫坐標、槲皮素質量濃度（c）為縱坐標，繪制標準曲線［6］。

1.2.3 總黃酮含量的測定

銀杏葉中總黃酮類活性成分的測定采用NaNO2－A1（NO3）3－NaOH絡合－分光光度法。取0.5mL樣品于25mL容量瓶中，分別加入0.5mL 5%亞硝酸鈉溶液，搖勻，放置5min后加0.5mL 10%硝酸鋁溶液，搖勻，放置6min后加10mL 4%氫氧化鈉溶液，用30%乙醇定容至刻度，搖勻，放置5～10min后于510 nm波長處測定吸光度，平行測定3次，按下式計算銀杏葉總黃酮提取率［［7－8］：

式中：c為總黃酮濃度，g·mL－1；V為提取液體積，mL；n為稀釋倍數；m為樣品質量，g。

1.2.4 單因素實驗

準確稱取1.0g樣品粉末，置于磨口錐形瓶中，按不同的料液比加入不同體積分數乙醇、在一定溫度下回流提取一定時間。抽濾，濾液離心，取上清液0.5mL，按照1.2.3方法測定吸光度，計算銀杏葉總黃酮提取率。

1.2.5 正交實驗設計

以單因素實驗為基礎設計正交實驗［9］。以料液比（A）、乙醇體積分數（B）、提取時間（C）、提取溫度（D）為考察因素，采用4因素3水平進行L16（34）正交實驗優化銀杏葉總黃酮的提取工藝［10－12］，正交實驗的因素與水平見表1。

表1 正交實驗的因素與水平Tab.1 Factors and levels of orthogonal experiment

1.2.6 微波輔助提取方法

準確稱取1.0g樣品粉末，置于磨口錐形瓶中，按照正交實驗優化的料液比加入相應體積分數的乙醇。選擇5種不同微波功率進行間歇式提取15次，每次10s。測定銀杏葉總黃酮的含量，考察間歇式微波輔助提取對提取率的影響。

2 結果與討論

2.1 單因素實驗結果

2.1.1 料液比對銀杏葉總黃酮提取率的影響

準確稱取銀杏葉粉末1g，按1∶25、1∶35、1∶40、1∶50和1∶55的料液比加入50%乙醇，在60℃下回流提取3.0h，經純化后測定吸光度，計算總黃酮提取率，結果見圖1。

由圖1可知，總黃酮提取率隨著料液比的減小（即提取劑用量的增加）而增大，料液比為1∶50時，總黃酮提取率最大，進一步增加提取劑用量，總黃酮提取率反而減小。增加提取劑的用量，物料體系與提取劑體系間的濃度差加大，有利于黃酮類物質的溶出；但過多的提取劑降低了銀杏葉總黃酮的濃度，使總黃酮的不穩定性增大從而容易損失，反而導致總黃酮提取率減小。

圖1 料液比對總黃酮提取率的影響Fig.1 The effect of solid－liquid ratio on the flavonoids extraction rate

2.1.2 乙醇體積分數對銀杏葉總黃酮提取率的影響

準確稱取銀杏葉粉末1g，按1∶50的料液比分別加入體積分數為40%、50%、60%、70%和80%的乙醇，在60℃下回流提取3.0h，經純化后測定吸光度，計算總黃酮提取率，結果見圖2。

圖2 乙醇體積分數對總黃酮提取率的影響Fig.2 The effect of volume fraction of ethanol on the flavonoids extraction rate

由圖2可知，總黃酮提取率隨著乙醇體積分數的增大而增大，乙醇體積分數為50%時，總黃酮提取率最大；當乙醇體積分數超過50%后，總黃酮提取率反而減小，至70%以后保持不變。可能的原因是高體積分數的乙醇更有利于黃酮類物質的溶解，同時高體積分數的乙醇對細胞的破壞性更強，有利于溶液滲透至物料中。然而，過高的乙醇體積分數可能增加脂溶性物質的溶出，導致總黃酮提取率減小。

2.1.3 提取時間對銀杏葉總黃酮提取率的影響

準確稱取銀杏葉粉末1g，在水浴溫度為60℃、乙醇體積分數為50%、料液比為1∶50的條件下，分別回流提取1.5h、2.0h、2.5h、3.0h、3.5h，純化后測定吸光度，計算總黃酮提取率，結果見圖3。

由圖3可知，總黃酮提取率隨提取時間的延長而增大，提取時間為3.0h時，提取率最大，之后提取率反而減小。

2.1.4 提取溫度對銀杏葉總黃酮提取率的影響

準確稱取銀杏葉粉末1g，乙醇體積分數為50%、料液比為1∶50，分別在40℃、50℃、60℃、70℃、80℃下回流提取3.0h，純化后測定吸光度，計算總黃酮提取率，結果見圖4。

圖4 提取溫度對總黃酮提取率的影響Fig.4 The effect of extraction temperature on the flavonoids extraction rate

由圖4可知，隨著提取溫度的升高，總黃酮提取率逐漸增大；提取溫度為70℃時，提取率最大；提取溫度超過70℃后，總黃酮提取率反而減小。這是因為，隨著提取溫度的升高，溶劑分子的運動加快，黃酮類物質溶出增加，但黃酮類物質作為一類具有抗氧化活性的物質，在高溫條件下，其結構被氧化破壞的速度也會加快；同時溶出的部分蛋白質在高溫下易變性與黃酮類物質發生共沉淀，導致總黃酮提取率減小。

2.2 正交實驗結果與分析（表2）

由表2可以看出，提取溫度對銀杏葉總黃酮提取率的影響最大，其次是乙醇體積分數，料液比和提取時間的影響最小；最佳組合為A1B2C2D2，即料液比1∶45、乙醇體積分數50%、提取時間2.0h、提取溫度70℃，在此條件下，銀杏葉總黃酮提取率達到0.918%。

2.3 微波輔助對銀杏葉總黃酮提取的影響

2.3.1 微波功率對總黃酮提取率的影響

表2 L16（34）正交實驗結果與分析Tab.2 The results and analysis of L16（34）orthogonal experiment

準確稱取銀杏葉粉末1g，在乙醇體積分數為50%、料液比為1∶45的條件下，分別用30W、240W、400W、640W和800W5種不同的微波功率進行微波輔助提取，純化后測定吸光度，計算總黃酮提取率，結果見圖5。

圖5 微波功率對總黃酮提取率的影響Fig.5 The effect of microwave power on the flavonoids extraction rate

由圖5可知，隨著微波功率逐步增大，總黃酮提取率相應增大，在微波功率為640W時，總黃酮提取率最大；之后，總黃酮提取率減小。可能是因為，微波的加熱作用使提取液溫度升高，或是微波本身對黃酮類物質的破壞。因此，選擇最適微波功率為640W。

2.3.2 微波間歇提取時間對總黃酮提取率的影響

準確稱取銀杏葉粉末1g，在微波功率為640W、乙醇體積分數為50%、料液比為1∶45、采用間歇式提取、每次10s的條件下，分別提取10次、15次、20次、25次、30次，純化后測定吸光度，計算總黃酮提取率，結果見圖6。

由圖6可知，隨著微波間歇提取時間的延長，提取率逐漸增大；微波間歇提取時間為15×10s時，提取率最大，為0.91%；進一步延長提取時間，提取率快速減小，可能是由于微波產生的高溫或微波直接對黃酮的破壞。與傳統方法相比，在相同提取條件下，采用微波提取在幾分鐘內的總黃酮提取率接近傳統方法3h的提取率。表明微波輔助提取能大大縮短銀杏葉總黃酮的提取時間，縮短提取周期。

圖6 微波間歇提取時間對總黃酮提取率的影響Fig.6 The effect of microwave intermittent extraction time on the flavonoids extraction rate

3 結論

研究了乙醇回流法提取銀杏葉總黃酮的工藝條件。通過單因素實驗考察了料液比、乙醇體積分數、提取時間、提取溫度對銀杏葉總黃酮提取率的影響，通過正交實驗確定優化的提取工藝條件為：料液比1∶45（g∶mL）、乙醇體積分數50%、提取時間2.0h、提取溫度70℃，在此條件下，銀杏葉總黃酮提取率為0.918%。同時，本實驗研究了微波輔助提取對銀杏葉總黃酮提取的影響，在微波功率為640W、用50%乙醇按1∶45的料液比間歇提取15次、每次10s的條件下，銀杏葉總黃酮提取率為0.91%，與傳統的加熱方法提取相比，大大地縮短了提取時間和提取周期。

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