索骨丹總蒽醌和鞣質對細胞因子的影響

王曉梅，趙 巖，樊曉娜，劉 丹，楊春娟，劉 帆

（1.寶雞文理學院化學化工學院，陜西 寶雞721013；2.寶雞市中醫醫院，陜西 寶雞721001）

索骨丹，又名秤桿七、老蛇盤、鬼燈檠、老漢求等，為虎耳草科索骨丹屬植物索骨丹（Rodgersia aesculifolia Batal.）的根莖，系陜西秦嶺山中的民間藥物。性味：澀，苦，微甘，平。功效：健脾燥濕，收斂固澀，止血，止瀉，止帶。用于濕阻脾胃、運化失司所致的納呆、腹脹、腹瀉、白帶，外傷出血、衄血，吐血、崩漏、脫肛、子宮脫垂，風濕筋骨痹痛、咽喉腫痛等癥，單用或配伍使用。由于治療范圍廣，在秦嶺當地應用較多［1－3］。索骨丹所含化學成分包括矮茶素、蒽醌、鞣質、黃酮、糖類等。作者就索骨丹總蒽醌和鞣質提取物對人單核細胞受脂多糖刺激后產生和釋放致炎細胞因子（IL－1β、IL－6、TNF－α）的影響，探討其對炎癥性疾病和免疫反應性疾病治療的部分機制，為秦嶺民間藥材的深入開發奠定基礎。

1 實驗

1.1 材料、試劑與儀器

索骨丹，購自太白山，經陜西中醫學院胡本祥教授鑒定。

人單核細胞白血病細胞THP－1、THP－1專用培養基（含1640、10%FBS＋b－巰基乙醇、青霉素、鏈霉素）；胰蛋白酶（Solon Ind.Pkwy）；Human TNF－αELISA試劑盒、Human IL－1βELISA試劑盒、Human IL－6 ELISA試劑盒，武漢博士德生物工程有限公司；脂多糖（LPS），科奧生物工程有限責任公司。

Galaxy 170S型CO2培養箱，德國Eppendorf公司；SW－CJ－2D型雙人單面凈化工作臺，蘇州凈化設備有限公司；Power Wave XS2型連續波長酶標儀，美國Bio Tek公司；R－1002型旋轉蒸發儀，鄭州長城科工貿有限公司；Advantage A10型超純水器，美國Merck Millipore公司；KQ5200E型超聲波清洗器，昆山超聲儀器有限公司；800B型離心機，上海安亭科學儀器廠。

1.2 方法

1.2.1 索骨丹總蒽醌和鞣質的提取

1）稱取粉碎的索骨丹50g，按固液比1∶10（g∶mL，下同）溶于80%乙醇中，于45℃超聲提取30 min，倒出上清液，沉渣再次提取，合并2次上清液，離心10min，將上清液濃縮至浸膏狀，用等體積氯仿萃取2次，棄去沉淀和氯仿層，取上層干燥即得索骨丹總蒽醌粉末。

2）稱取粉碎的索骨丹50g，按固液比1∶20溶于95%乙醇中，于50℃超聲提取40min，倒出上清液，沉渣再次提取，合并2次上清液，抽濾，棄去殘渣，將濾液減壓蒸餾，餾分即為鞣質粗液；加入等體積乙醚萃取，分出水液層，再用等體積乙酸乙酯萃取，棄去沉淀，水液層及乙酸乙酯層經減壓濃縮即得索骨丹鞣質。

1.2.2 THP－1細胞培養

THP－1細胞培養于含10%胎牛血清的THP－1專用培養基中，在37℃、5%CO2及飽和濕度的培養箱內培養，72h換液傳代1次，取第5～15代細胞進行實驗。將單核細胞接種于6孔板，每孔約106～107個細胞，加入含10%胎牛血清培養基5mL，含藥組加入藥物培養24h，加入脂多糖，繼續培養12h，收集培養液上清待檢測。

細胞處理及分組：（1）脂多糖組：加入脂多糖溶液，終濃度100ng·mL－1。（2）含藥組：加入脂多糖溶液，終濃度100ng·mL－1；蒽醌溶液及鞣質溶液濃度分別為0.50mg·mL－1、0.75mg·mL－1、1.00mg·mL－1、1.25mg·mL－1及1.50mg·mL－1。（3）對照組：加入與脂多糖等體積的培養基。

1.2.3 培養液中細胞因子的檢測

采用酶聯免疫吸附實驗（ELISA）方法檢測，嚴格按照ELISA檢測試劑盒說明書進行操作，在酶聯免疫檢測儀上測定450nm處各孔的吸光度值。

1.2.4 統計學處理

2 結果與討論

2.1 索骨丹總蒽醌對細胞因子產生和釋放的影響（表1）

表1 索骨丹總蒽醌對細胞因子產生和釋放的影響Tab.1 The effects of anthraquinones fromRodgersia aesculifolia Batal.on the producing and releasing of cytokines

由表1可知：索骨丹總蒽醌對IL－1β、IL－6和TNF－α的產生和釋放均有不同程度的抑制作用。當索骨丹總蒽醌濃度為0.50mg·mL－1時，其對IL－1β具有抑制作用，但無統計學意義，當濃度在0.75～1.50mg·mL－1范圍時，其抑制作用具有統計學意義（P＜0.05）；索骨丹總蒽醌對IL－6的作用同樣是低濃度（0.50mg·mL－1，0.75mg·mL－1）時雖有抑制作用，但無統計學意義，而當濃度在1.00～1.50mg·mL－1范圍時，抑制作用具有統計學意義（P＜0.05）；索骨丹總蒽醌各濃度對TNF－α均有顯著性抑制作用（P＜0.05）。由表1還可知，索骨丹總蒽醌對TNF－α的抑制作用最強，對IL－1β的抑制作用次之，而對IL－6的抑制作用最弱。

2.2 索骨丹鞣質對細胞因子產生與釋放的影響（表2）

由表2可知，索骨丹鞣質各濃度均對TNF－α的產生和釋放具有顯著性抑制作用（P＜0.05）。

實驗還發現，索骨丹鞣質對IL－1β和IL－6也有一定的抑制作用，但無統計學意義（P＞0.05）。

表2 索骨丹鞣質對細胞因子TNF－α產生與釋放的影響Tab.2 The effects of tannins fromRodgersia aesculifolia Batal.on the producing and releasing of cytokine TNF－α

2.3 討論

單核細胞來源于骨髓中的造血干細胞，在血液中停留2～3d后遷移到周圍組織中，繼續發育成為成熟的細胞。組織中的單核細胞稱為組織巨噬細胞，單核巨噬細胞膜外有被脂多糖識別并結合的受體，當脂多糖與受體結合后，即活化細胞內的相應區域，激活了的單核組織細胞能生成并釋放多種細胞毒素、干擾素和白細胞介素，參與機體防衛機制。此外，由于脂多糖的作用持續存在，進一步加強上述過程，從而出現正反饋調節［4］。

細胞因子是由多種細胞所分泌的小分子多肽的統稱，參與調節細胞生長分化、調節免疫功能及參與炎癥發生和創傷愈合等?，F已確認的致炎細胞因子主要有TNF－α、IL－1β和IL－6等，這些細胞因子在生物損傷的病理過程中扮演重要的角色［5－6］。TNF－α來源廣泛，體內的多種細胞，如單核巨噬細胞可通過脂多糖、細菌、病毒等刺激因素產生和釋放TNF－α。TNF－α除具有強大的抗腫瘤作用外，還能促進IL－1、IL－2、IL－6的產生及分泌，誘發炎癥反應。過量的TNF－α可破壞機體的免疫平衡，與其它炎癥因子共同產生多種病理損傷。Ferrari等研究表明，腫瘤壞死因子系統與其它細胞因子共同構成了一個復雜的免疫網絡，參與了類風濕關節炎、強脊炎、糖尿病等多種自身免疫性疾病的發生及發展［7］。IL－1在體內細胞來源廣泛，幾乎各種有核細胞都能產生IL－1。IL－1β主要由活化的單核吞噬細胞產生［8］。IL－1生物學效應非常重要的方面是參與炎癥反應，會引發全身性癥狀如發熱、肌消耗和急性期蛋白的合成，在局部時則引起組織炎癥和破壞性病變［9］。IL－6是參與免疫調節和炎性反應的重要細胞因子之一，是宿主對感染和組織損傷所引起反應的主要介質。病毒、細菌感染均能誘導體內IL－6表達增加［10］。

實驗中，索骨丹總蒽醌對IL－1β、IL－6和TNF－α的產生和釋放均有不同程度的抑制作用，其中各濃度的總蒽醌對TNF－α均有抑制作用，且抑制程度強于對IL－1β、IL－6的作用。當總蒽醌濃度較低時，其對IL－1β、IL－6的抑制作用無顯著性差異，濃度較高時抑制作用具有統計學意義，說明其作用與藥物濃度具有一定的關系。索骨丹鞣質各濃度對TNF－α具有很強的抑制作用，而對IL－6和IL－1β的抑制作用較弱且無統計學意義。索骨丹治療范圍廣，在治療慢性消化系統疾?。ㄈ鐫冃越Y腸炎）及風濕性疾病中使用較多，而這些疾病的發病機制中都存在IL－1β、IL－6和TNF－α表達過高的情況，索骨丹的治療作用可能部分是通過抑制炎癥細胞因子的釋放，進而減輕病變局部急慢性炎癥反應、降低對組織的破壞、控制組織慢性增生而實現的。由此推斷，其健脾燥濕、除痹止痛等功能可能對應地包括了對以上幾種細胞因子的抑制作用。索骨丹所含化學成分復雜，其對炎癥性疾病的療效可能是某種成分發揮主要的作用，也可能是多種有效成分相互作用的結果，其確切的治療機制還需要進行大量研究才能得以明確。

3 結論

觀察索骨丹總蒽醌和鞣質對3種致炎細胞因子（IL－1β、IL－6、TNF－α）的影響，進而探討其治療炎癥性疾病的部分機制。將體外培養的人單核細胞分為脂多糖組、不同濃度的含藥組及陰性對照組。除對照組外，各組均加入相同量的脂多糖后繼續培養12h，收集上清液，采用ELISA法通過酶標儀測得各組溶液的吸光度值，再計算出各組細胞因子的濃度。結果發現：索骨丹總蒽醌除0.50mg·mL－1組外，0.75～1.50mg·mL－1各組均能降低IL－1β含量（P＜0.05）；索骨丹總蒽醌在1.00～1.50mg·mL－1范圍時可降低IL－6含量（P＜0.05）；索骨丹總蒽醌各濃度對TNF－α均有顯著性抑制作用（P＜0.05）。索骨丹鞣質各濃度對TNF－α均有顯著性抑制作用（P＜0.05）。表明，索骨丹提取物可通過減少IL－1β、IL－6和TNF－α的產生和釋放而發揮治療作用。

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