異甘草素增強(qiáng)大鼠腦基底動脈平滑肌細(xì)胞BKCa電流

田偉偉，王 蕊，張傳林，趙 磊，馬克濤，李 麗，司軍強(qiáng)

(石河子大學(xué) 醫(yī)學(xué)院 1.生理教研室；2.新疆地方與民族高發(fā)病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 新疆 石河子 832002)

缺血性腦血管病約占腦血管病的80%，腦缺血后引起的腦卒中、血管性癡呆和認(rèn)知功能障礙合并阿爾茨海默病等嚴(yán)重威脅人類健康[1]。大電導(dǎo)鈣激活鉀通道(large-conductance calcium-activated potassium channels; BKCachannel; BKCa)是血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cell, VSMC)上具有負(fù)反饋調(diào)節(jié)的重要K+通道。BKCa通道的激活會產(chǎn)生一個(gè)瞬時(shí)外向鉀電流，使VSMC膜電位發(fā)生超極化，導(dǎo)致血管舒張[2]。異甘草素(isoliquiritigenin, ISL)源于豆科植物甘草的根, 串果藤和香殊蘭的球莖等，具有抗腫瘤、抗氧化和抗感染等作用[3]，對腦缺血再灌注損傷和老年性癡呆也具有改善和保護(hù)作用[4]，但其對腦血管的作用及其機(jī)制尚不清楚。本研究觀察ISL對Wistar大鼠腦基底動脈VSMC BKCa通道的調(diào)節(jié)作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

Wistar大鼠，SPF級，雌雄不拘，體質(zhì)量為200～300 g(新疆自治區(qū)疾病控制中心動物飼養(yǎng)科提供，許可證編號SCXK 新2011- 0001)。

1.2 試劑

所用藥物用DMSO 液配制，通過開關(guān)控制藥物灌流速度、溫度和其他成分。ISL(純度>98%)、四乙胺(tetraethyl ammonium，TEA)、苯腎上腺素(phenylephrine，PE)(Sigma公司)，其余均為國產(chǎn)分析純試劑。

1.3 單個(gè)腦基底動脈VSMC的制備

給大鼠腹腔注射10%水合氯醛(0.3 mL/100 g)麻醉后，斷頭處死，迅速取腦，置于預(yù)先配制的細(xì)胞外液中，快速取出腦基底動脈并將周圍結(jié)締組織分離。單個(gè)腦基底動脈VSMC的制備參照文獻(xiàn)[5]。

1.4 腦基底動脈直徑的測量

腦基底動脈血管段操作方法參照文獻(xiàn)[6]，血管段在水浴槽中孵育20 min穩(wěn)定后，分別給予1×10-5mol/L PE(1)、1×10-5mol/L PE+1×10-4mol/L ISL和1×10-5mol/L PE(2)，記錄血管段直徑的變化。

1.5 全細(xì)胞膜片鉗記錄技術(shù)

在室溫條件下(22 ℃～25 ℃) 使用Axon700B放大器(Axon公司)進(jìn)行單個(gè)腦基底動脈VSMC全細(xì)胞膜片鉗實(shí)驗(yàn)，全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)參照文獻(xiàn)[7]。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 ISL舒張大鼠腦基底動脈

1)用PE(1)(1×10-5mol/L)0.9%氯化鈉溶液(physiologic salt solution, PSS)灌流后，血管直徑為 (320±11)μm；2)用ISL(1×10-4mol/L) 和PE(1×10-5mol/L) 的PSS液體灌流后，血管直徑為(379±10)μm；3)用PE(2)(1×10-5mol/L) 的PSS液體再次灌流后，血管直徑為(332±10)μm(圖1A)。與1×10-5mol/L PE(1)組和1×10-5mol/L PE(2)組相比，1×10-5mol/L PE+1×10-4mol/L ISL組的血管直徑明顯增大(P<0.05)(圖1B)。

A:1.the isolated cerebral basilar artery was incubated with PE(1×10-5 mol/L) for 20 min, and the diameter was 309 μm, 2.after perfusion with PE (1×10-5 mol/L) and ISL(1×10-4 mol/L), the diameter was 399 μm, 3.after washing with PE(1×10-5 mol/L) for 20 min, the diameter was 304 μm, that indicated ISL relaxed the cerebral basilar artery; B:ISL relaxed cerebral basilar artery (n=6); *P<0.05 compared with control[1×10-5 mol/L PE(1) and 1×10-5 mol/L PE(2)]圖1 異甘草素舒張腦基底動脈Fig 1 ISL relaxed the cerebral basilar artery

2.2 ISL呈電壓依賴性增強(qiáng)腦基底動脈VSMC外向電流

在0～60 mV區(qū)間內(nèi)，ISL(1×10-4mol/L)呈電壓依賴性增強(qiáng)腦基底動脈VSMC外向電流(表1，圖2)。

表1 ISL呈電壓依賴性增強(qiáng)血管平滑肌細(xì)胞外向電流Table 1 ISL enhanced outward currents of VSMCs in voltage-dependent manner (±s，n=6)

*P<0.05,**P<0.01 compared with control.

A.10-4mol/L ISL increased the outward currents of VSMC in voltage-dependent manner from 0～60 mV, B.ISL enhanced the outward currents；*P<0.05,**P<0.01compared with control

圖2ISL呈電壓依賴性增強(qiáng)腦基底動脈VSMC外向電流
Fig2ISLenhancedoutwardcurrentsofVSMCinvoltage-dependentmanner(n=6)

2.3 ISL呈濃度依賴性增強(qiáng)腦基底動脈VSMC外向電流

1×10-7、1×10-6、1×10-5、1×10-4和3×10-4mol/L ISL使VSMC電流(+60 mv)分別從(144±25)pA增加到(156±24)pA、(173±24)pA、(211±21)pA、(252±21)pA和(262±20)pA(圖3A)。與對照組相比，除1×10-7mol/L ISL組外，其余各組外向電流呈濃度依賴性增強(qiáng)(P<0.05)(圖3B)。

2.4 ISL增強(qiáng)由BKCa介導(dǎo)的腦基底動脈VSMC外向電流

預(yù)灌流1×10-3mol/L TEA 3 min，再給予1×10-3mol/L TEA+1×10-4mol/L ISL，ISL增強(qiáng)VSMC外向電流的作用被阻斷，且外向電流(+60 mV)減小到(86±22)pA(圖4A)，只有對照組的0.65±0.04倍(P<0.05)(圖4B)。

3 討論

ISL屬于黃酮類化合物，可引起豚鼠氣管平滑肌的舒張，具有解痙及平喘的功能[8]。本結(jié)果顯示ISL可以舒張大鼠腦基底動脈，呈電壓依賴性和濃度依賴性增強(qiáng)腦基底動脈VSMC外向電流。BKCa通道阻斷劑TEA不僅阻斷了ISL對腦基底動脈VSMC外向電流的增強(qiáng)作用，而且明顯減小了對照組外向電流幅值。提示ISL可通過激活BKCa通道，引起K+外流，從而促使VSMC超極化發(fā)揮擴(kuò)張血管的作用。

ISL在1～100 μmol/L范圍內(nèi)呈濃度依賴性增強(qiáng)大鼠主動脈中可溶性鳥苷酸環(huán)化酶(sGC)的活性，顯著提高cGMP的含量，少量增加cAMP的含量[9]。cGMP和cAMP可以使BKCa通道相關(guān)蛋白發(fā)生磷酸化和增強(qiáng)鈣火花頻率，導(dǎo)致BKCa通道的激活，從而使平滑肌產(chǎn)生舒張效應(yīng)[10]。

A.with the increase of ISL concentration, the outward currents of VSMC enhanced; B.ISL enhanced the outward current, EC50of ISL enhanced the VSMC outward current was 9.5 μmol/L;*P<0.05 compared with control

圖3ISL呈濃度依賴性增強(qiáng)腦基底動脈VSMC外向電流
Fig3ISLenhancedtheoutwardcurrentsofVSMCinconcentration-dependentmanner(n=6)

A.TEA(1×10-3mol/L) inhibited ISL-induced (1×10-4mol/L) outward currents of VSMC; B.effect of TEA on ISL-induced outward currents;*P<0.05,**P<0.01 compared with control

圖4ISL增強(qiáng)BKCa通道介導(dǎo)的外向電流
Fig4ISLenhancedtheoutwardcurrentsmediatedbyBKCachannel(n=6)

VSMC內(nèi)游離Ca2+主要貯存在肌質(zhì)網(wǎng)(sarcoplasmic reticulum, SR)，胞內(nèi)Ca2+的釋放主要由SR上IP3受體和ryanodine受體調(diào)控[11]。ryanodine受體介導(dǎo)的鈣誘導(dǎo)的鈣釋放(Ca2+-induced Ca2+release,CICR)和IP3受體介導(dǎo)的鈣釋放[inositol 1,4,5-trisphosphate(IP3)-induced Ca2+release, IICR]產(chǎn)生的局部鈣瞬變?nèi)玮}火花(Ca2+sparks)可以激活胞膜上BKCa通道，產(chǎn)生自發(fā)性瞬時(shí)外向電流(spontaneous transient outward currents, STOCs)，胞膜發(fā)生超極化，進(jìn)而發(fā)揮舒血管效應(yīng)[12]。而鈣火花和STOCs與SR中的鈣負(fù)荷有緊密聯(lián)系，當(dāng)SR中鈣離子負(fù)荷低于靜息水平60%時(shí)，鈣火花和STOCs的幅度和頻率會明顯減小，增加SR中的鈣負(fù)荷會顯著增強(qiáng)鈣火花的幅度和頻率，這可能是SR內(nèi)鈣離子驅(qū)動力的改變導(dǎo)致的[13]。PKG可以使SR上的鈣泵(sarcoplasmic reticulum Ca2+-ATPase, SERCA)相關(guān)蛋白(phospholamban, PLB)發(fā)生磷酸化，促進(jìn)鈣泵對鈣的攝取，增加SR內(nèi)的鈣離子負(fù)荷[14]。且蛋白激酶G(protein kinase G, PKG)和蛋白激酶A(protein kinase A, PKA)可以通過增加SR內(nèi)鈣離子負(fù)荷來增強(qiáng)鈣火花的鈣離子敏感性，從而增強(qiáng)BKCa通道的活性[15]。所以，ISL引起大鼠腦基底動脈VSMC胞膜BKCa介導(dǎo)的外向電流增加的機(jī)制可能是：ISL增加胞內(nèi)cGMP和cAMP含量，一方面使BKCa通道相關(guān)蛋白發(fā)生磷酸化，直接激活BKCa通道；另一方面增加胞內(nèi)SR的鈣負(fù)荷，增強(qiáng)鈣離子敏感性和鈣火花的頻率，增強(qiáng)BKCa通道的活性。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)ISL增強(qiáng)大鼠腦基底動脈VSMC BKCa通道介導(dǎo)的外向電流，從而引起VSMC發(fā)生超極化發(fā)揮舒血管作用，但其對腦基底動脈中cGMP和cAMP含量的影響及其機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

[1] 張國瑾, 趙增榮.國外腦血管疾病研究進(jìn)展 [M]. 北京:中國醫(yī)藥科技出版社, 2000: 177- 917.

[2] Yang Y, Li P Y, Cheng J,etal. Function of BKCachannel is reduced in human vascular smooth muscle cells from Han Chinese patients with hypertension [J]. Hypertension, 2013, 61: 519- 525.

[3] 李德芳,王振華,鄭秋生,等.異甘草素的藥理作用研究[J].時(shí)珍國醫(yī)國藥,2010, 21: 362- 364.

[4] Zhan C, Yang J. Protective effects of isoliquiritigen in in transient middle cerebral artery occlusion-induced focal cerebral ischemia in rats [J]. Pharmacology, 2006, 53: 303- 306.

[5] 張傳林, 王蕊, 馬克濤, 等. 大黃素增強(qiáng)SD大鼠腦基底動脈平滑肌細(xì)胞BKCa電流[J]. 中國藥理學(xué)通報(bào), 2013, 29: 1244- 1247.

[6] 張雯, 馬克濤, 李麗，等. 18β-甘草次酸對KCl和苯腎上腺素誘導(dǎo)的大鼠離體腎臟葉間動脈收縮的抑制作用[J]. 生理學(xué)報(bào), 2014, 66: 195- 202.

[7] 李新芝，司軍強(qiáng)，張忠雙，等. 急性缺氧增強(qiáng)豚鼠小腦前下動脈平滑肌細(xì)胞外向電流并抑制縫隙連接[J]. 生理學(xué)報(bào), 2011, 63: 533- 539.

[8] 劉斌, 楊靜. 異甘草素對豚鼠離體氣管平滑肌收縮功能的影響[J]. 中國藥理學(xué)通報(bào), 2005, 21: 892.

[9] Sheu-Meei Yu, Sheng-Chu Kuo.Vasorelaxant effect of isoliquiritigenin, a novel soluble guanylate cyclase activator, in rat aorta [J]. Br J Pharmacol, 1995, 114: 1587- 1594.

[10] Robertson BE, Schubert R, Hescheler J,etal. cGMP dependent protein kinase activates Ca-activated K channels in cerebral artery smooth muscle cells [J]. Am J Physiol Cell Physiol, 1993, 265: 299- 303.

[11] 王瑞婷, 郝?？? 鈣通道及細(xì)胞內(nèi)鈣釋放機(jī)制[J]. 承德醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào), 2000, 17:166- 169.

[12] 李鵬云,曾曉榮,楊艷.平滑肌肌漿網(wǎng)Ca2+釋放與STOCs相關(guān)性的研究進(jìn)展[J]. 醫(yī)學(xué)綜述, 2006, 12: 76- 70.

[13] ZhuGe.R, R. A. Tuft. The influence of sarcoplasmic reticulum Ca2+concentration on Ca2+sparks and spontaneous transient outward currents in single smooth muscle cell [J]. Gen. Physiol, 1999, 113: 215- 228.

[14] Joshi Shreena, Nelson Mark T, Werner Matthias E. Amplified NO/cGMP-mediated relaxation and ryanodine receptor-to BKCachannel signalling in corpus cavernosum smooth muscle from phospholamban knockout mice [J]. Br J Pharmacol, 2011, 165, 455- 466.

[15] Jaggar JH, Porter VA, Nelson MT,etal. Calcium sparks in smooth muscle [J]. Am J Physiol Cell Physiol, 2000, 278: 235- 256.